潘春华[1]2004年在《树突状细胞抗原递呈功能及其结构基础的研究》文中提出一．研究目的： 本研究的拟建立成熟的、功能良好的DC细胞的培养体系，即：DC细胞形态典型、表达特征性的CD分子、能够诱导T淋巴细胞活化、增殖、亚群分化、分泌特征性细胞因子；研究DC细胞的超微结构并在纳米级水平上做进一步结构分析，用荧光探针寻找DC细胞成熟标志的CD分子(CD83、CD1a)、第二信号CD分子(CD86、CD80)和代表亚群来源的CD11c分子的表达位置，推测免疫应答的发生部位；观察免疫应答时DC细胞与T淋巴细胞的相互作用、形态学变化和Ca2+的动态变化。 二、材料和方法： (一)主要试剂和设备： 1．试剂： AIM-V培养基、rhGM-CSF、rhIL-4、小鼠抗人FITC标记的CD86、HLA-DR、CD11c、Lin-1、CD4、IgG2a、CD45RA、CD69、Lin-1及小鼠抗人PE标记的CD83、CD86、CD80、CD3、CD123、CD40、CD4、CD25、CD28、CD45RO、IFN-γ和IL-4；小鼠抗人CD4-APC、CD8PE—Cy5、HLA-DR-percp、Mouse IgGl-PE和Mouse IgGl-FITC的MoAb；Annexin V-FITC／PⅠ双染法流式细胞分析试剂盒。 2．设备： 二氧化碳电热恒温箱、流式细胞仪、Nikon倒置显微镜及相机、扫描电镜、透射电镜、原子力显微镜、共聚焦显微镜 (二)实验方法 1．对有无悬浮细胞的条件下，用含有rhGM—CSF 800~(?)／ml、IL-4 500~(?)／和TNF-α250~(?)／ml的无血清培养基，诱导培养DC细胞，并在光镜下每天记录形态学变化； 2．胞仪分析DC细胞Lin—HLA-DR+细胞群的CD83、CD1a、CD86、CD80、CD11c、CD123的表达情况； 3．胞仪分析DC细胞递呈抗原后T细胞的CD69变化，进而分析CD4+T细胞的CD4／CD3、CD4／CD25、CD45RO／CD45RA、CD4／CD28亚群以及CD8+T细胞的CD8／CD3、CD8／CD25、CD45RO／CD45RA、CD8／CD28亚群比例的变化情况;4.当DC细胞被抑制时，用RNAase抑制RNA、核酸染料PI标记细胞DNA，在流式细胞仪上分析在T细胞的周期变化;5.流式细胞仪分析T细胞分泌的细胞因子IFN一Y和IL一4的情况，间接获悉T细胞的定向分化;6.AnnexinV一FITC/PI双染法流式细胞分析试剂盒分析DC细胞递呈抗原后的凋亡情况;扫描电镜和透射电镜分析DC细胞表面和细胞内的超微结构，寻找其结构特征;7.利用AFM在纳米水平上进一步分析DC细胞的超微结构以及其与T细胞作用方式;8.免疫电镜观察CD86的表达位置;9.利用共聚焦显微镜分析DC细胞的特征性CD分子的表达情况，观察DC细胞与T细胞的作用过程、DC细胞吞噬抗原的过程、DC细胞内游离CaZ十的变化过程以及DC细胞凋亡的过程叁、结果:1.光镜下见贴壁细胞在培养过程中(7天)逐渐长出长短不一树突状突起，细胞形态不一;电镜观察到DC表面呈多层“面纱”覆盖，有大量皱褶，“面纱”边缘有长短不一的不规则的树突状突起，每个突起有多级分枝;AFM见DC细胞的“面纱”状结构是由多级树突状突起相互缠绕形成的，各个DC细胞之间的突起相互连接，构成集落;2.DC细胞表型在Lin--和HLA一DR+细胞群中，各CD分子表达的百分比为:CD123/54.5、CDlle/88.99、CD4O/56.65、CDla/69.36、CD86/92.57、CDSO/70.79、CD83/85.91;3.DC细胞递呈抗原后T细胞的CD69明显升高，CD4+CD69+/19.05%;CDS+CD69+/21，93%;4.CD4+和CDS+的两组细胞的CD3+、CD25+、CD45RO+/CD45RA+的百分率均增高，CD28+的百分率和CD45RO一/CD45RA+的百分率均下降;CD4+/CD28-和CDS+/CD28一的百分率亦升高;5.DC细胞递呈抗原后，T细胞的S期细胞的比率从0.66%增加为7.21%;而DC的死亡率和凋亡率，分别由0.05%和0.00%升为6.95%和4.65%; 36.DC细胞含有丰富的线立体、微管和微丝系统;凋亡的DC细胞，其细胞核染色质固缩，内吞体严重扩张，细胞膜空泡化;7.CD86分子主要聚集于胞体特定的区域内，突起部位表达较少，CD83和CDla表达在细胞膜上，而CDllc则表达在细胞体部位;8.羊抗小鼠IgG一F工TC分子随时间不同逐渐由细胞膜分布到整个DC细胞;9.DC细胞递呈抗原后，CaZ+浓度升高，随即细胞破裂。四.结论:1.该方法可以诱导出的成熟DC细胞，形态典型，而且少量悬浮细胞不影响DC细胞的分化和成熟;“面纱”状结构是由多级树突状突起相互缠绕形成，扩大了DC细胞的膜结构，是有效捕获抗原的结构基础;2.DC细胞多个亚群可共存生长，绝大多数为MDC，而且成熟度高并表达丰富的双信号分子;3.DC细胞具有吞噬功能，可以诱导T细胞活化、增殖，具有递呈抗原功育旨;4.DC细胞递呈抗原后，在T细胞的作用下，DC细胞伴随细胞内CaZ十浓度的升高走向凋亡和死亡，且凋亡为非同步性。
盛茂[2]2004年在《环孢素A对小鼠未成熟树突状细胞抗原递呈功能和同种移植耐受的影响》文中研究表明目的:研究环孢素A对小鼠树突状细胞抗原递呈功能及其对同种移植耐受的影响。方法在体外对小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞，与环孢素A共同培养，观察与对照组在成熟进程和膜表面分子表达、分泌IL-12、对同源T细胞反应等的差异：对小鼠同种异体心脏移植模型，利用环孢素A处理供者来源的树突状细胞，观察对移植物存活影响、受者T辅助细胞因子变化和微嵌合形成。对实验结果进行方差分析和S-N-K检验，以P<0.05为有统计学意义。结果环孢素A延缓小鼠树突状细胞成熟，抑制MHC和共刺激分子表达以及IL-12的分泌，与对照组有显着性差异：环孢素A作用的树突状细胞可延长小鼠同种移植心脏存活，降低受体T细胞反应性，促使嵌合体形成。与对照组差异有统计学意义。结论环孢素A可通过延缓DC成熟，影响MHC和共刺激分子的表达，抑制受者T细胞反应，从而诱导移植耐受。
闫鹏[3]2012年在《小剂量X射线对人外周血树突状细胞功能影响研究》文中指出目的观察小剂量X射线照射对体外培养不同时间的人外周血树突状细胞（dendriticcell, DC）凋亡、成熟能力、抗原递呈能力和致敏T细胞能力的影响并探讨其初步机制，为系统研究小剂量照射对人免疫功能影响提供实验依据。方法分离人外周血单个核细胞（PBMC），以细胞因子GM-CSF及IL-4诱导分化、肿瘤抗原及TNF-α刺激DC成熟，以LIN抗体纯化，HLA-DR和CD11C抗体鉴定。实验分为叁组：A组：DC培养至第2天接受X线照射；B组：DC培养至第6天接受X线照射，A、B组细胞受照剂量分别为0.05Gy、0.1Gy、0.2Gy和0.5Gy；对照组为假照射组。照射后24h及48h分别以Annexin V联合PI双染法检测DC凋亡率，流式细胞仪检测细胞膜表面分子标记物CD80、CD83表达量；各组DC培养至第8天时，以DC致敏T细胞，CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测混合淋巴细胞反应（MLR，mixed lymphocyte reaction)；MTT法检测A549细胞数量；ELISA检测DC细胞培养液中白介素12（IL-12）、淋巴细胞培养液中γ-干扰素（IFN-γ）水平。结果1.按本实验方法培养的DC成熟度高，纯度高，可用于本研究。2.0.5Gy照射培养不同时间DC，A、B两组24、48h检测凋亡率显着高于对照组(A组24、48h, t值分别2.88，2.54；B组24、48h，t值分别为2.97，3.73,P <0.05)，其它剂量组无显着差异（P>0.05）。3.0.2Gy、0.5Gy照射后，A组CD80、CD83表达量显着下降（P<0.05），B组CD80、CD83表达量显着上升（P<0.05）；其它剂量组无显着差异（P>0.05）。4.受到0.2Gy、0.5Gy照射的DC，培养至第8天时其致敏T细胞增殖的数量，A组显着低于对照组（t值分别为2.79、3,71，P<0.05），B组明显高于对照组（t值分别为3.60、3.11，P<0.05），其它剂量组无显着差异（P>0.05）；0.2Gy、0.5Gy照射，A组DC分泌IL-12水平明显下降（t值分别为4.44、6.93，P<0.05），B组DC分泌IL-12水平明显上升（t值分别为3.51、4.12，P<0.05），其它剂量组无显着差异（P>0.05）。5. DC致敏T淋巴细胞对A549的杀伤能力：0.2Gy、0.5Gy照射后，A组明显低于对照组（t值分别为2.89、2.91, P<0.05），B组显着高于对照组（t值分别为2.91、2.82, P<0.05）；0.05Gy和0.1Gy照射后，A组及B组与对照组比较，所测各指标无明显变化(P>0.05)。0.2Gy、0.5Gy照射后，A组DC致敏的T细胞分泌IFN-γ水平下降，而B组DC致敏的T细胞分泌IFN-γ水平明显上升(P<0.05)；0.05Gy和0.1Gy照射后，A组及B组与对照组比较，所测各指标无明显变化(P>0.05)。结论0.5Gy X射线照射后24h及48h，DC的凋亡率显着增加。培养早期(2d，A组)接受0.2Gy及0.5Gy X射线照射的DC，在培养至第8天时，其成熟能力、抗原递呈能力、分泌IL-12的能力以及致敏T细胞能力均显着降低；培养晚期(6d，B组)接受0.2Gy及0.5Gy X射线照射的DC，在培养至第8天时，其成熟能力、抗原递呈能力、分泌IL-12的能力以及致敏T细胞的能力显着增强。该发现对研究小剂量核辐射对人免疫系统功能影响、探索一种体外提高DC功能的新方法提供了实验依据。
郑红刚, 朴炳奎, 林洪生, 熊露, 花宝金[4]2007年在《中药复方肺瘤平膏对树突状细胞功能影响的拆方研究》文中进行了进一步梳理目的观察肺瘤平膏及其拆方干预体外培养体系中树突状细胞(DC)抗原递呈功能的作用并探讨其分子机制。方法建立体外人外周血单个核细胞(PBMC)诱导分化成熟DC的诱导培养体系,从健康人外周血中分离获得PBMC,采用多种细胞因子(TNFα、IL-4、GM-CSF)联合诱导,获得了分化与功能相对成熟的DC,用流式细胞仪检测肺瘤平膏及其拆方含药血清干预DC与抗原递呈功能相关表面分子表达,及其对DC分泌IL-12含量的影响,进行初步研究。结果肺瘤平膏可上调DC与抗原递呈功能相关膜分子MHC-Ⅱ、CD80、CD83、CD86及CD40的表达,并促进DC分泌IL-12含量。结论肺瘤平膏能够调节DC抗原递呈功能,提高机体的抗肿瘤免疫监视功能。
郭靖, 王震平, 梁华平, 谭立志[5]2007年在《失血合并闭合性骨折致小鼠脾脏树突状细胞抗原递呈功能下降》文中研究指明目的研究失血合并闭合性骨折对小鼠脾脏树突状细胞(DC)抗原递呈功能的影响并初步探讨其机制。方法致伤后24小时分离小鼠脾脏DC,检测脾脏DC在体外抗原作用下刺激脾非黏附细胞增殖的能力、细胞因子分泌功能及其表面重要分子表达的情况。结果创伤小鼠脾脏DC体外刺激脾非黏附细胞增殖的能力下降,细胞因子分泌水平发生了变化,流式细胞分析结果显示其成熟度下降。结论失血合并闭合性骨折可致小鼠脾脏DC的抗原递呈功能下降。
盖丽丽[6]2007年在《小柴胡片对慢性乙肝患者外周血树突状细胞抗原递呈的影响》文中研究表明研究目的1．了解正常人与慢乙肝患者外周血单核细胞来源的树突状细胞(dendritic cell DC)是否具有功能上的差异，探讨慢乙肝患者体内HBV持续感染的机制。2．从细胞免疫学角度评价小柴胡片治疗前后慢乙肝病人外周血DC的抗原提呈功能的变化，并探讨打破HBV持续感染状态可能办法。3．探索HBcAg负载对DC抗原提呈能力及刺激CTL特异性活化的影响，从而尝试将HBcAg负载作为刺激慢乙肝病人DC功能恢复或上调的新办法。研究方法1．慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的分离培养：收集临床试验中出现良好临床应答的5例患者的肝素抗凝外周血，用密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞(PBMC)，调整细胞浓度至2×10~6个／孔，接种于6孔细胞培养板，贴壁培养3小时后，获得单核细胞，再添加rhGM-CSF和rhIL-4终浓度分别达到100ng／ml和500U／ml，置37℃、5％CO_2细胞培养箱继续培养，至第7天添加rhTNF-α，使其终浓度达到60ng／ml，继续培养至第11天，荧光显微镜下采集成熟DC的图像。收集培养的DC，运用流式细胞术检测DC表面标志CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达水平，并将DC与自体T淋巴细胞进行自体混合淋巴细胞反应(AMLR)鉴定DC刺激T细胞增殖的能力。2．HBcAg负载对DC刺激细胞增殖能力和CTL分泌IFN-γ水平的影响：我们引入了具有极强免疫原性的HBcAg刺激培养治疗后的慢乙肝患者DC，通过流式细胞术和自体混合淋巴细胞反应(AMLR)分析负载前后DC表面标志表达水平和刺激淋巴细胞增殖能力的变化，再利用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)，分析抗原负载后DC对于CTL的活化，特别是IFN-γ的分泌水平的变化，考察慢性乙型肝炎患者治疗后临床指标的改善与机体内细胞免疫功能之间是否存在联系。3．HBcAg负载的DC对CTL应答的影响：CTL应答的强弱可以通过细胞毒性试验进行判定。我们将治疗后的慢乙肝患者DC用HBcAg负载后作为刺激细胞与自体的外周血淋巴细胞混合培养为效应细胞，以人肝癌细胞系HepG2和转染了HBV病毒的HepG2.2.1.5细胞作为靶细胞，运用乳酸脱氢酶释放试验(LDH释放试验)检测CTL对两种靶细胞的杀伤作用，进而评价HBcAg负载DC对CTL应答能力的作用。研究结果1．成功诱导培养出5例正常人及5例获得临床应答的慢乙肝患者外周血单核来源DC，并进行了鉴定：培养11天后，在荧光显微镜下可以看到细胞体积明显增大，胞体可见大量毛发样突起，细胞形态不规则，呈半悬浮生长状态，细胞增殖不明显，具备典型DC的形态学特征；正常人群与CHB患者的外周血DC在分子表面标志CD1a、CD80、CD83、CD86的表达分别为(49.8±3.3)％VS(40.5±2.9)％、(75.0±1.2)％VS(43.3±1.9)％、(21.3±2.8)％VS(6.8±1.4)％、(56.0±1.1)％VS(72.3±3.0)％，两组间比较有显着差异(P＜0.01)；而HLA-DR则分别为(95.7±1.2)％和(96.7±1.0)％，两组间比较无显着差异(P=0.120)；正常人和CHB患者DC与自体T细胞在1：60混合比的刺激指数SI分别为(2.20±0.14)VS(1.84±0.03)，两者比较有显着差异(t=5.722，P=0.000)2．CHB患者接受治疗前后CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达率分别为(40.5±2.9)％VS(41.1±2.6)％、(43.3±1.9)％VS(44.1±2.0)％、(6.8±1.4)％VS(8.6±0.8)％、(72.3±3.0)％VS(73.1±2.3)％和(96.7±1.0)％VS(97.1±0.7)％，治疗前后无显着差异(P=0.748，0.488，0.122，0.543，0.503)；经HBcAg刺激的DC与无HBcAg刺激的DC相比，两者的分子表面标志表达率也基本无太大的改变，但其中的CD83的表达分别为(11.0±1.2)％和(8.6±0.8)％，两者比较有显着差异(P＜0.05)；在最适混合比培养下，正常人组与CHB治疗前、CHB治疗后(无HBcAg负载)和CHB治疗后(HBcAg负载)的DC刺激增殖SI分别为：2.20±0.14、1.85±0.03、1.95±0.03、2.06±0.02和1.95±0.03，组间比较有显着差异(P＜0.000，P＜0.005，P＜0.000)。HBcAg负载DC刺激PBLs与无HBcAg负载DC刺激PBLs均能活化较多的CTL，并分泌出较高水平的IFN-γ，5例CHB病人分别用HBcAg负载的DC刺激PBLs，均显示出强烈的刺激CTL分泌IFN-γ的作用，与无HBcAg负载的DC相比，其刺激强度有显着差异(P＜0.05)。3．5例接受治疗的CHB患者的外周血单核来源DC经过HBcAg刺激后，对于两种靶细胞——HepG2和HepG2.2.1.5细胞的杀伤率分别为(57.93±3.00)％和(77.73±3.63)％，两者间比较有显着差异(t=-16.284，P=.000)；未经HBcAg刺激的DC对两种靶细胞——HepG2和HepG2.2.1.5细胞的杀伤率分别为(47.42±2.02)％和(64.45±1.76)％，两者间比较也有显着差异(t=-24.559，P=0.000)；无HBcAg负载DC刺激自体PBLs与未受DC刺激的自体PBLs对两种靶细胞HepG2和HepG2.2.1.5细胞的杀伤率之间也有显着差异(t=-13.527，P=0.000；t=-15.526，P=0.000)；HBcAg负载DC刺激自体PBLs与未受DC刺激的自体PBLs对两种靶细胞HepG2和HepG2.2.1.5细胞的杀伤率之间也有显着差异(t=-3.881，P=0.001；t=-22.345，P=0.000)；5例接受治疗的CHB患者DC经HBcAg刺激或无HBcAg刺激与HepG2反应产生CTL杀伤率各自进行比较，分别为：(56.40±1.57)％VS(46.60±4.12)％、(59.17±2.64)％VS(49.20±0.46)％、(55.67±0.71)％VS(48.00±1.44)％、(58.23±1.10)％VS(46.60±0.89)％和(62.00±0.44)％VS(46.70±0.75)％，病例1经HBcAg刺激与否的自身比较无显着差异(t=2.83，P=0.104)，病例2、3、4、5经HBcAg刺激与否的自身比较均有显着差异(P=0.016，0.010，0.006.0.001)；5例慢性乙型肝炎患者DC经HBcAg刺激或无HBcAg刺激与HepG2.2.1.5反应产生CTL杀伤率各自进行比较，分别为：(74.67±1.29)％VS(61.90±0.60)％、(81.77±0.72)％VS(63.73±0.21)％、(74.17±1.40)％VS(64.47±0.85)％、(76.33±1.34)％VS(65.73±1.21)％和(81.70±1.45)％VS(64.40±0.70)％，5个病例经HBcAg刺激与否的自身比较均有显着差异(P=0.003，0.000，0.012.0.005，0.006)。研究结论1．CHB患者外周血DC刺激自体淋巴细胞增殖能力下降。我们认为，DC的刺激增殖能力下降与其表面黏附分子的表达下降有一定关系，可能是表面黏附分子的表达下降导致DC抗原提呈能力的下降，进而影响了DC的刺激增殖能力。提高CHB患者DC的抗原提呈能力可能有助于HBV感染者体内的病毒清除。2．慢乙肝病人接受小柴胡汤治疗前后DC的表面标志表达水平无显着差异，但治疗后的表达呈上升趋势，表明治疗后CHB患者外周血DC的黏附分子的表达得到了一定程度上调，经HBcAg刺激后CD83表达水平的上调，可能与DC的成熟度提高、抗原提呈能力的恢复有一定关系；综合表面标志表达水平、AMLR和ELISPOT的结果，我们认为，HBcAg负载可以使治疗后患者的DC抗原提呈能力得到上调或恢复，从而使DC启动的Th和CTL细胞免疫应答得到增强或恢复。3．CHB患者DC经HBcAg冲击后，能有效提呈HBcAg，诱导HBcAg特异性CTL反应。我们的实验证实，慢性乙型肝炎患者单核细胞来源的DC经HBcAg抗原冲击后，能有效的诱导HBV特异性CTL。该结果为DC作为免疫佐剂进行慢性乙型肝炎免疫治疗提供了有益的实验依据。小柴胡汤作为治疗慢乙肝的有效方剂已被大量的临床及实验研究证实，其具有免疫调节作用，对多种细胞因子的调节均有影响。考虑入选本次研究的患者仅接受了小柴胡汤片剂的治疗，并未进行西医临床的抗病毒治疗，结合我们整个DC功能的实验究结果分析，可以推断，小柴胡汤片剂可能对患者外周血DC的抗原提呈功能的恢复或上调具有一定作用，因而可能使免疫功能得到一定提高。
卢高峰[7]2007年在《干扰素α、恩替卡韦和胸腺肽α1对慢性乙肝患者树突状细胞功能的体外影响》文中研究说明背景和目的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一全球性的公共健康问题，我国是乙型肝炎高流行国家。慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者往往迁延不愈，常由肝炎发展为肝硬化，甚至肝癌，在此过程中机体免疫反应发挥着重要作用。研究证明，乙肝慢性化的重要机制之一是HBV抗原特异性T细胞免疫耐受，患者不能产生针对HBV特异的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫反应，所以不能清除体内病毒。造成CHB免疫耐受的重要原因之一是患者体内树突状细胞(dendritic cell，DC)缺陷，不能把病毒抗原的信号有效传递给机体免疫系统。因此，恢复DC数量或加强DC抗原递呈功能，充分激活机体免疫反应已成为治疗CHB的重要途径之一。DC是能激活初始化T淋巴细胞的重要抗原递呈细胞，在抗病毒细胞免疫中起重要作用。通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)体外诱导、扩增可以获得足够的外周血单核细胞来源DC(monocyte-derived DC，MoDC)。CD1a主要表达于人胸腺细胞和DC，是人DC相对特征性标志，CD83是成熟DC的重要标记，CD80、HLA-DR是其表面重要的共刺激分子。干扰素α(interferon-α，IFN-α)和核苷(酸)类似物是目前国内外公认的慢性乙肝抗病毒治疗药。IFN-α除直接抑制HBV复制外，通过增强机体对HBV的免疫力也是一重要的途径，其机制较复杂；恩替卡韦(entecavir，ETV)是一新型口服核苷类药物，在细胞内经磷酸化后，与脱氧胞嘧啶核苷(dCTP)竞争进入病毒合成中的DNA链，终止病毒DNA的复制。胸腺肽α1可增强非特异性免疫功能，多用于联合治疗CHB。但这些药物对于CHB患者DC的影响，文献报道较少，尤其是ETV作为目前临床上最强的CHB抗病毒药，对于机体免疫系统的影响未见报道。本研究以IFN-α、ETV和胸腺肽α1分别与CHB的外周血MoDC体外共孵育，通过测定DC表面CD1a、CD83、CD80、HLA-DR等表型分子的表达，检测DC培养液中IL-6、IL-12含量和同种异体混合淋巴细胞反应等一系列指标观察它们对CHB的DC生物学特性的影响，为临床上应用以上药物及其与DC疫苗相结合治疗CHB寻找实验依据。材料与方法采集CHB患者及健康人外周新鲜静脉血以肝素抗凝后通过淋巴细胞分离液体外密度梯度离心分离获得单个核细胞，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬单个核细胞后接种到24孔细胞培养板静置2小时，轻轻洗脱未贴壁悬浮细胞，贴壁细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养基(含10ng/ml rhGM-CSF和5ng/ml rhIL-4)诱导扩增，37℃、5％CO_2饱和湿度的细胞培养箱中培养。隔天半量换液。第5天收集DC，将CHB来源DC分别加入一定浓度的IFN-α(300U/ml)、胸腺肽α1(0.1μg/ml)和ETV(0.05μg/ml)分为IFN-α组、胸腺肽α1组、ETV组和IFN-α+胸腺肽α1组，同时设健康对照组和CHB对照组，继续共培养，第8天收获各组DC进行以下相关检测：1．倒置显微镜下动态观察细胞形态变化。2．流式细胞仪(FCM)测定DC表型分子CD1a、CD83、CD80及HLA-DR的表达。3．同种异体混合淋巴细胞反应法测定DC刺激淋巴细胞增殖能力。4．ELISA法检测DC培养上清中IL-12、IL-6含量。结果1．培养第8d观察各组细胞，健康对照组培养液中漂浮着较多云雾状的DC细胞团，表面突起丰富；各药物处理组均可见表面突起丰富的DC；CHB对照组DC多呈不规则形、多角形；健康对照组和各CHB药物处理组细胞分化形态优于CHB对照组。2．培养第8d的各组DC表型分子CD1a、CD80、CD83和HLA-DR的表达，在健康对照组明显高于CHB对照组和各CHB药物处理组(P＜0.05)；CHB对照组低于各CHB药物处理组(P＜0.05)；IFN-α+胸腺肽α1组、IFN-α组和胸腺肽α1组无统计学差别(P＞0.05)，但均高于ETV组(P＜0.05)。3．健康对照组DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力最强；CHB对照组DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力最弱；各CHB药物处理组强于CHB对照组；IFN-α+胸腺肽α1组、IFN-α组和胸腺肽α1组无统计学差别(P＞0.05)，但均高于ETV组(P＜0.05)。4．各组DC培养上清液中IL-12含量为健康对照组最高，其次为各CHB药物处理组，CHB对照组最低(P＜0.05)；IL-6含量与之相反(P＜0.05)。结论1．采用rhGM-CSF和rhIL-4联合诱导的方法可以成功地从外周血单核细胞中体外诱导分化成DC，为进一步实验研究提供足量的细胞。2．CHB的DC与健康人相比其分化较差，膜表面分子CD1a、CD80、CD83和HLA-DR表达降低，刺激淋巴细胞增殖能力及分泌IL-12的能力低下，提示其功能缺陷，可能是HBV慢性感染的重要原因之一。3．IFN-α、ETV和胸腺肽α1都可以不同程度提高CHB的DC表面分子CD1a、CD83、CD80、HLA-DR的表达，促进其分泌细胞因子IL-12和增强DC刺激淋巴细胞增殖能力，提高细胞免疫的功能。4．在促进DC功能方面，ETV较IFN-α和胸腺肽α1作用弱；IFN-α联合胸腺肽α1与单用IFN-α或胸腺肽α1差别无统计学意义。
张鑫雷, 应志豪[8]2015年在《黄曲霉素B1对鸡骨髓源树突状细胞抗原递呈能力的影响》文中研究表明通过黄曲毒素B1作用于体外培养的鸡树突状细胞,再与T细胞相互作用并测定增殖能力。结果表明,黄曲毒素B1作用于树突状细胞24 h后,极显着下调了T细胞的增殖指数(P<0.01),表明黄曲霉素B1破坏了鸡树突状细胞的抗原递呈能力。
郑红刚, 朴炳奎, 林洪生, 熊露, 花宝金[9]2007年在《肺瘤平膏及其拆方对树突状细胞抗原递呈功能影响的分子机制研究》文中进行了进一步梳理目的:观察肺瘤平膏及其拆方干预体外培养体系中DC抗原递呈功能的作用并探讨其分子机制。方法:建立体外人血PBMC诱导分化成熟DC的诱导培养体系,从健康人外周血中分离获得PBMC,采用多种细胞因子(TNFα、IL-4、GM-CSF)联合诱导,获得了分化与功能相对成熟的DC,并采用流式细胞仪检测技术,对肺瘤平膏及其拆方含药血清干预成熟DC与抗原递呈功能相关表面分子表达,及其对DC分泌IL-12水平影响进行初步研究。结果:肺瘤平膏可上调DC与抗原递呈功能相关膜分子MHC-Ⅱ、CD80、CD83、CD86及CD40的表达,并促进DC分泌IL-12水平,其方中扶正部分的作用不容忽视。结论:在扶正培本治则指导下的肺瘤平膏能够调节DC抗原递呈功能,提高机体的抗肿瘤免疫监视功能。
许望东[10]2015年在《活性氧与SLE外周血单核细胞来源的树突状细胞细胞因子分泌、抗原递呈能力的关联研究》文中研究表明研究背景系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种累及多系统、多器官、临床表现复杂、病程迁延反复的自身免疫性疾病,对患者的身心健康造成较大危害,是一个重要的公共卫生问题。尽管SLE的发病机制未完全阐明,但已有的证据表明,疾病的发病与遗传因素和环境因素相关,引起机体免疫异常,尤其是免疫细胞表达和(或)功能紊乱:如对自身抗原的耐受失衡,自身反应性的T淋巴细胞和B淋巴细胞活化紊乱,细胞因子功能发挥失控以及针对抗双链DNA、核小体、核蛋白的自身抗体过度产生。由此导致的自身反应性抗体大量聚集会引起补体活化、免疫复合物沉积,最终引起组织和(或)器官损伤。树突状细胞(dendritic cell,DC)广泛表达于体内,通常起着免疫监视、抗原递呈和免疫耐受的作用。DC作为特殊的“哨兵细胞”,在固有免疫与适应性免疫间起着重要的桥梁作用。DC表达特殊的模式识别受体,如Toll样受体,C型凝集素受体,RIG-I样受体以及NOD样受体。DC通常可以分为两大类:浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid DC,p DC)和常规树突状细胞(conventional DC,c DC)。DC的模式识别受体通过结合到微生物的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern molecules,PAMPs)或者内源性分子的损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern molecules,DAMPs),以捕获抗原。当DC成功捕获抗原后,DC将历经成熟:(1)上调表面分子和共刺激分子的表达;(2)启动和调节T淋巴细胞和B淋巴细胞的功能;(3)分泌一些细胞因子,从而调控和极化其他效应分子的功能。DC可以通过几种方式影响SLE的发病,如递呈自身抗原给自身反应性T淋巴细胞,产生促炎性细胞因子。SLE与MHC单倍体显着相关,表明T淋巴细胞应答在疾病的形成中发挥重要作用。有研究发现狼疮鼠体内TLR7过表达会加剧疾病的发生、发展,这一过程与固有刺激启动相关,并且完全依赖于MHC单倍型,提示DC可能参与了递呈染色质和RNA相关的蛋白质给自身反应性T淋巴细胞。活化的c DC能产生IL-12p70,而IL-12p70会促进T淋巴细胞中IFNγ的形成,这将导致初始T淋巴细胞分化成Th1细胞;p DC能产生I型干扰素,而I型干扰素会促进c DC成熟,降低使Toll样受体活化的阈值。因此,DC在SLE发病中可以通过影响炎症性细胞因子的产生而起作用。活性氧(reactive oxygen species,ROS)包括很多分子实体,如非自由基氧化剂H2O2,NO衍生的过氧亚硝酸盐,或者含未成对电子的自由基,如羟基自由基、NO和超氧。细胞内的NADPH氧化酶在受到外界刺激后会产生ROS,胞内物质如过氧化物酶和线粒体在氧代谢时所产生的生化反应也会产生ROS。已有研究表明,ROS对信号转导通路发挥直接作用,从而对细胞运动、分化和凋亡产生重要影响。ROS能够诱导DC成熟,影响DC分泌促炎性细胞因子。DC内含有像NADPH氧化酶那样发挥作用所需的物质。当DC与微生物成分或同源T淋巴细胞相互作用时,DC产生ROS。因此,ROS可能作为DC的内源性调节体影响DC的功能发挥。已有报道,ERK(extracellular regulated protein kinases)通路是MAPK通路中高度保守的通路,参与了多种细胞功能的发挥。ERK及其磷酸化的形态、ROS在SLE中表达异常,与疾病活动度相关,但现有的研究并未揭示单核细胞来源的树突状细胞(monocytes-induced dendritic cells,mo DC)中磷酸化的ERK(phosphorylation of ERK,p ERK)、ROS表达是否异常,mo DC分泌的炎症性细胞因子是否异常,p ERK的表达是否与ROS相关,炎症性细胞因子的分泌是否与ROS相关,ROS会否经p ERK通路影响炎症性细胞因子的分泌。此外,本研究将探讨mo DC的抗原递呈能力,以Th17细胞分化为例,推测其抗原递呈能力是否改变,且是否与ROS相关。这些研究将增进对mo DC内ROS表达和(或)功能的了解。第一部分SLE患者外周血单核细胞来源的树突状细胞内ROS表达研究目的从人外周血中提取出单核细胞诱导成树突状细胞后,比较SLE患者(新发病例,病情稳定期病例)和正常对照的树突状细胞内ROS表达水平差异,以探索ROS与SLE之间的关联。方法在获取研究对象知情同意后采用自行设计的问卷进行调查,同时抽取15ml抗凝外周静脉血,经淋巴细胞分离液分选出外周血单个核细胞,通过磁珠分选的方法提取出单核细胞,经完全培养基和诱导剂(rh GM-CSF+rh IL-4)培养7天,测定mo DC内ROS表达水平:收集SLE病例20例(新发病例11例,病情稳定期病例9例),健康对照20例;病例和对照组各分为LPS刺激组和未刺激组。或从人外周血中分离出单核细胞后,经含SLE血清的培养基培养7天,测定mo DC内ROS表达水平:收集SLE病例10例(新发病例5例,病情稳定期病例5例),健康对照10例;病例和对照组各分为LPS刺激组和未刺激组。采用SPSS10.01软件对数据进行统计分析。病例与对照数据进行比较时,符合正态分布且方差齐者采用t检验,不符合正态分布者采用Man-Whitney U检验。以P<0.05作为统计学差异的标准。结果(1)经完全培养基和诱导剂(rh GM-CSF+rh IL-4)培养mo DC时:20例SLE病例均为女性;20例健康对照中,女性19例、男性1例。病例组平均年龄为32.0±7.9岁(年龄分布从20到44岁);健康对照组平均年龄为34.1±12.8岁(年龄分布从22到59岁)。①健康对照与病情稳定期病例做比较时,mo DC未经LPS刺激,ROS表达水平在两者间比较的P=0.402;moDC经LPS刺激时,P=0.566。②健康对照与新发病例做比较时,mo DC未经LPS刺激,ROS表达水平在两者间比较的P=0.358;mo DC经LPS刺激时,P=0.670。③不考虑疾病活动度,将病情稳定期病例与新发病例合为一体,与健康对照做比较时,mo DC未经LPS刺激,ROS表达水平在两者间比较的P=0.194;mo DC经LPS刺激时,P=0.646。④考虑LPS刺激前后对健康对照或SLE病例自身mo DC的影响:健康对照未经LPS刺激的ROS表达水平/病情稳定期病例未经LPS刺激的ROS表达水平,与健康对照经LPS刺激的ROS表达水平/病情稳定期病例经LPS刺激的ROS表达水平做比较,即健康对照与病情稳定期病例经刺激前后的比值间的比较,P=0.441;健康对照未经LPS刺激的ROS表达水平/新发病例未经LPS刺激的ROS表达水平,与健康对照经LPS刺激的ROS表达水平/新发病例经LPS刺激的ROS表达水平做比较,即健康对照与新发病例经刺激前后的比值间的比较,P=0.075。不考虑疾病活动度,将病情稳定期病例与新发病例合为一体:健康对照未经LPS刺激的ROS表达水平/SLE病例未经LPS刺激的ROS表达水平,与健康对照经LPS刺激的ROS表达水平/SLE病例经LPS刺激的ROS表达水平做比较,即所有健康对照与所有SLE病例经刺激前后的比值间的比较,P=0.062。(2)经含SLE血清的培养基培养mo DC时:10对SLE病例和健康对照中,女性均为9例、男性各1例。病例组平均年龄为33.3±9.1岁(年龄分布从20到48岁);健康对照组平均年龄为32.7±8.9岁(年龄分布从23到48岁)。①健康对照与病情稳定期病例做比较时,mo DC未经LPS刺激,ROS表达水平在两者间比较的P=0.064;mo DC经LPS刺激时,P=0.834。②健康对照与新发病例做比较时,mo DC未经LPS刺激,ROS表达水平在两者间比较的P=0.530;mo DC经LPS刺激时,P=0.292。③不考虑疾病活动度,将病情稳定期病例与新发病例合为一体,与健康对照做比较时,mo DC未经LPS刺激,ROS表达水平在两者间比较的P=0.791;mo DC经LPS刺激时,P=0.496。④考虑LPS刺激前后对健康对照或SLE病例自身mo DC的影响:健康对照未经LPS刺激的ROS表达水平/病情稳定期病例未经LPS刺激的ROS表达水平,与健康对照经LPS刺激的ROS表达水平/病情稳定期病例经LPS刺激的ROS表达水平做比较,即健康对照与病情稳定期病例经刺激前后的比值间的比较,P=0.447;健康对照未经LPS刺激的ROS表达水平/新发病例未经LPS刺激的ROS表达水平,与健康对照经LPS刺激的ROS表达水平/新发病例经LPS刺激的ROS表达水平做比较,即健康对照与新发病例经刺激前后的比值间的比较,P=0.293。不考虑疾病活动度,将病情稳定期病例与新发病例合为一体:健康对照未经LPS刺激的ROS表达水平/SLE病例未经LPS刺激的ROS表达水平,与健康对照经LPS刺激的ROS表达水平/SLE病例经LPS刺激的ROS表达水平做比较,即所有健康对照与所有SLE病例经刺激前后的比值间的比较,P=0.821。结论本研究表明:SLE病例与健康对照外周血单核细胞来源的树突状细胞,其ROS表达水平在两组间无显着性差异。第二部分ROS与树突状细胞炎症性细胞因子分泌的关联研究目的比较SLE患者(新发病例)和正常对照的树突状细胞内p ERK表达水平及分泌的炎症性细胞因子差异。分析ROS与p ERK及炎症性细胞因子间的关联。方法经完全培养基和诱导剂(rh GM-CSF+rh IL-4)、含SLE血清的培养基两种方法培养新发病例与健康对照的mo DC时(前者为11对,后者为5对),收集上清液,-80℃冻存留待检验。采用ELISA试剂盒检测上清液中与Th1,Th2,Th17相关的炎症性细胞因子IL-2,IL-6,IL-10,IL-17的表达水平。新发病例和健康对照各分为LPS刺激组和未刺激组。此外,收集经完全培养基和诱导剂(rh GM-CSF+rh IL-4)培养的新发病例与健康对照的mo DC(11对,未经LPS刺激),裂解细胞,经蛋白质印迹法(Western blot)检测病例组与对照组间p ERK表达水平。分析ROS表达水平与炎症性细胞因子表达水平、p ERK表达水平之间的关联。本研究所采用的病例组、对照组细胞来自于第一部分培养的细胞。数据的分析采用SPSS10.01软件进行,以α=0.05为检验水准。结果(1)两种方法培养mo DC时,新发病例与健康对照的mo DC,无论经LPS刺激还是未刺激,IL-2、IL-6、IL-10、IL-17的表达水平在二者间均无统计学差异(P>0.05)。(2)经完全培养基和诱导剂培养mo DC时,新发病例组与健康对照组的mo DC未经LPS刺激,p ERK表达水平在病例组中明显低于健康对照组(P=0.031)。(3)ROS表达水平与炎症性细胞因子表达水平、pERK表达水平间均无显着性关联(P>0.05);此外,p ERK表达水平与炎症性细胞因子表达水平间无统计学关联(P>0.05)。结论本研究发现:与Th1,Th2,Th17相关的炎症性细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-17在新发病例与健康对照间无统计学差异,但p ERK表达水平在新发病例组中明显低于健康对照。然而炎症性细胞因子(IL-2、IL-6、IL-10、IL-17)的分泌可能与ROS无关联。第叁部分ROS与树突状细胞抗原递呈能力关联探讨,以Th17分化为例目的将新发病例与健康对照的单核细胞培养成树突状细胞(mo DC),然后分别与健康对照的CD4+T细胞进行共培养,以探讨mo DC的抗原递呈能力,以Th17分化为例。分析ROS表达水平与Th17分化间的关系,以推测mo DC抗原递呈能力的改变是否与ROS相关。方法新发病例和健康对照的单核细胞经含SLE血清的培养基培养4天(新发病例和健康对照各5例);获mo DC后,分为不同的浓度组,再与健康对照(同一人)的T细胞(浓度恒定)进行共培养6天,然后用ELISA法检测上清液中与Th17分化相关的炎症性细胞因子TGF-β、IL-6的表达水平;流式细胞仪检测Th17细胞的表达水平在二者间的差异。分析ROS表达水平与炎症性细胞因子表达水平、Th17细胞表达水平的关联。本研究所采用的病例组、对照组细胞来自于第一部分培养的细胞。数据的分析采用SPSS10.01软件进行,以α=0.05为检验水准。结果(1)新发病例、健康对照的mo DC,分别与同一健康对照的CD4+T细胞共培养后,TGF-β、IL-6的表达水平在二者间无统计学差异(P>0.05)。(2)新发病例、健康对照的mo DC,分别与同一健康对照的CD4+T细胞共培养后,Th17细胞的表达水平在二者间无统计学差异(P>0.05)。(3)ROS表达水平与炎症性细胞因子表达水平、Th17细胞表达水平间均无显着性关联(P>0.05)。结论本研究表明:mo DC的抗原递呈能力在病例组与健康对照组间无显着性差异(以Th17研究为例),mo DC抗原递呈能力的变化(诱导Th17分化)可能与ROS无关。
参考文献：
[1]. 树突状细胞抗原递呈功能及其结构基础的研究[D]. 潘春华. 第一军医大学. 2004
[2]. 环孢素A对小鼠未成熟树突状细胞抗原递呈功能和同种移植耐受的影响[D]. 盛茂. 第二军医大学. 2004
[3]. 小剂量X射线对人外周血树突状细胞功能影响研究[D]. 闫鹏. 辽宁医学院. 2012
[4]. 中药复方肺瘤平膏对树突状细胞功能影响的拆方研究[J]. 郑红刚, 朴炳奎, 林洪生, 熊露, 花宝金. 北京中医药大学学报. 2007
[5]. 失血合并闭合性骨折致小鼠脾脏树突状细胞抗原递呈功能下降[J]. 郭靖, 王震平, 梁华平, 谭立志. 创伤外科杂志. 2007
[6]. 小柴胡片对慢性乙肝患者外周血树突状细胞抗原递呈的影响[D]. 盖丽丽. 广州中医药大学. 2007
[7]. 干扰素α、恩替卡韦和胸腺肽α1对慢性乙肝患者树突状细胞功能的体外影响[D]. 卢高峰. 郑州大学. 2007
[8]. 黄曲霉素B1对鸡骨髓源树突状细胞抗原递呈能力的影响[J]. 张鑫雷, 应志豪. 现代农业科技. 2015
[9]. 肺瘤平膏及其拆方对树突状细胞抗原递呈功能影响的分子机制研究[J]. 郑红刚, 朴炳奎, 林洪生, 熊露, 花宝金. 中华中医药学刊. 2007
[10]. 活性氧与SLE外周血单核细胞来源的树突状细胞细胞因子分泌、抗原递呈能力的关联研究[D]. 许望东. 安徽医科大学. 2015