导读:本文包含了嗜热蛋白酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:蛋白酶,突变,动力学,蛋白,脯氨酸,成熟,常数。
嗜热蛋白酶论文文献综述
詹冬玲,高楠,韩葳葳,冯雁[1]（2014）在《嗜热蛋白酶PH1704别构中心量子化学计算与突变体动力学》一文中研究指出通过量子化学计算,确定嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3的PH1704蛋白酶别构位点的关键残基为Arg113,Tyr120和Asn129.其中,Arg113及Asn129与别构抑制剂结合,参与别构调控.Tyr120残基位于亚基交界面附近,并与亲核残基Cys100之间以氢键相连,可通过影响亚基聚合来影响酶的亲核催化.DJ-1超家族的4种构建蛋白的结构显示,120位点位于亚基交界面处,影响亚基的聚合,进而影响蛋白酶的活力,并间接参与别构调控.分子生物学实验显示,突变体R113T/Y120P/N129D的k cat/k m(L·μmol-1·min-1)值是野生型k cat/k m值的6倍,h系数由野生型的0.86转变为1.3,负协同效应消失.113和129位点处阴离子别构剂脱离,从而破坏113,120和129位点间的封闭环结构,使AC交界面α7螺旋(124~129,524~529)间聚合度增强;120位点残基由Tyr转变为Pro,与Cys100间氢键断裂,亲核进攻的阻力减小,从而使酶活力提高,别构负调控消失.(本文来源于《高等学校化学学报》期刊2014年01期）
朱晖[2]（2013）在《嗜热蛋白酶WF146加工成熟的分子机制研究》一文中研究指出Subtilases (Subtilisin-like serine proteases,枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶)是广泛存在于细菌、古生菌以及真核生物中的一类丝氨酸蛋白酶,它在生物体的多种生理活动中发挥着重要的作用,例如蛋白质代谢、酶原活化等。Subtilases通常以无活性的前体形式合成,必须经历加工成熟过程才能转变为有活性的成熟酶,这种加工成熟的过程能够精确调节Subtilases活性的释放及功能的发挥。嗜热Subtilases是研究酶的温度适应机制的重要实验材料,同时也在工业应用上具有重大潜能,因而受到了人们的广泛关注。对适应不同温度的Subtilases的加工成熟过程的研究,不仅能帮助我们更好地理解它们的温度适应机制,同时也为在工业应用中制备有活性的Subtilases提供更多有价值的信息。嗜热蛋白酶WF146是来源于嗜热细菌Bacillus sp. WF146中的一种胞外Subtilases。它在细胞内以前体的形式合成,包括信号肽、N端前肽和成熟酶区叁部分。我们以大肠杆菌为宿主对WF146蛋白酶进行异源表达,产生的WF146蛋白酶酶原以可溶形式存在于细胞内。该酶原(43kDa)在60℃保温时,可以自加工去除N端前肽而转变为32kDa的成熟酶,说明重组酶原已经折迭为正确结构。本论文将在此基础上开展嗜热蛋白酶WF146加工成熟的分子机制研究。首先,我们研究了WF146蛋白酶可能的成熟途径,通过构建该酶活性位点突变体来捕捉成熟过程中可能存在的加工产物及中间体。研究结果显示：当WF146蛋白酶的活性位点Ser249突变为Ala后,该突变体丧失成熟的能力,表明活性位点是酶原去除N端前肽所必需,确定WF146蛋白酶酶原的自加工成熟过程依赖于其自身成熟酶区的活性；当活性位点Ser249突变为Cys后,WF146蛋白酶可以自加工为33kDa的中间体,但是不能进一步加工为成熟酶；当野生型酶原在有丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)存在的情况下于60℃保温时,我们观察到酶原成熟过程中有33kDa的中间体的积累。这些实验结果表明,WF146蛋白酶酶原在自催化(Auto-catalytic)成熟过程中经历了一个中间体阶段,在此过程中对N端前肽的加工采用的是两步加工机制。首先,N端前肽的主体部分(N*)被成熟酶区活性位点顺式加工(cis-processing),形成中间体；然后,N*与成熟酶区之间的连接肽段被截短,中间体转变为成熟酶。此外,WF146蛋白酶酶原的自催化成熟还能通过成熟酶对酶原中N*与成熟酶区之间的连接肽段进行反式加工(trans-processing)来进行。我们还发现,与大多数其他Subtilases不同,WF146蛋白酶的成熟过程除了可以依靠自身成熟酶区的活性来引发之外,也可以依靠外源蛋白酶的活性来引发。通过圆二色谱分析,我们发现WF146蛋白酶在加工成熟过程中发生细微结构调整。通过限量酶解实验,我们发现酶原中N端前肽部分对蛋白酶降解敏感,而成熟酶区则十分稳定,这一结构特点使得酶原可以通过反式加工去除N端前肽而完成成熟过程。其次,我们对Ca2+在WF146蛋白酶加工成熟过程中的作用进行了详细研究。WF146蛋白酶与嗜冷蛋白酶S41和嗜温蛋白酶Sphericase分别具有68%和67%的氨基酸序列一致性,后两种酶中均含有相同的五个Ca2+结合位点。通过氨基酸序列比对我们发现WF146蛋白酶至少含有四个与之相对应的Ca2+结合位点。Ca2+对WF146蛋白酶的活性、稳定性及加工成熟过程都具有重要作用。在螯合剂EDTA存在时,WF146蛋白酶酶原在60℃可以顺式加工为一种特殊的N端前肽-中间体复合物,这种中间体不能进一步加工为成熟酶,而是在降低温度或(和)加入Ca2+后能够与N端前肽重新连接为酶原。通过圆二色谱法分析,我们发现当除去溶液中的Ca2+后,WF146蛋白酶酶原的结构变得不稳定。这些结果说明,Ca2+具有维持WF146蛋白酶的结构稳定性的作用,酶原分子通过结合Ca2’形成稳定结构而保证加工成熟过程的顺利进行。最后,我们对WF146蛋白酶的N端前肽功能进行了研究,同时对它成熟过程中的两个加工位点间的连接肽段(12个氨基酸残基)进行了突变及功能分析。结果表明,WF146蛋白酶酶原中的N端前肽能够作为分子内伴侣协助成熟酶区正确折迭,同时也是成熟酶的活性抑制剂。WF146蛋白酶成熟过程中的两个加工位点间的连接肽段对N端前肽分子内伴侣及活性抑制剂功能没有影响。这段连接肽段中富含带负电荷的Glu残基(5个),将这5个Glu残基同时突变为其它类型的氨基酸残基(分别突变为Gln, Ala, Gly, Lys)后并未影响到成熟酶的性质,但是会使酶原成熟过程加快。当我们对连接肽段进行缺失突变后,WF146蛋白酶酶原的折迭及加工过程受到影响。我们推测该连接肽段在酶原的加工成熟过程中具有调节作用,保证该酶在合适的时间和位置释放活性,避免过早释放蛋白酶活性而对细胞造成损害。(本文来源于《武汉大学》期刊2013-04-01）
詹冬玲,高楠,韩葳葳,冯雁[3]（2013）在《分子对接和动力学模拟提高嗜热蛋白酶PhpI的活力》一文中研究指出通过分子对接和动力学模拟对嗜热蛋白酶的分子进行改造,确定蛋白酶PH1704(PhpI)定点突变残基,并通过分子生物学实验进行验证.突变体K43C的蛋白酶活力提高了5.8倍.分子动力学模拟结果表明,经过8 ns的动力学模拟后,K43C突变体二级结构由野生型的S2片层(F11-E12-D13)变成环状结构.E12和K43均是活性位点的重要残基,这种变化将导致活性位点的柔性增强,有利于催化反应的发生.(本文来源于《高等学校化学学报》期刊2013年03期）
白鹤[4]（2010）在《定点突变探讨嗜热蛋白酶PhpI活性调控机制》一文中研究指出蛋白酶作为一类典型的水解酶,被广泛的应用于医药、食品、酿造等与生活息息相关的领域当中。而来源于超嗜热微生物的蛋白酶,由于其特殊的热稳定性,相比于中温酶具有着无法比拟的优势,所以对于嗜热蛋白酶结构与功能以及催化机制的研究也越来越广泛。超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii中的嗜热蛋白酶Protease I (PhpI)属于DJ-1/ThiJ/PfpI超家族,PfpI(Pyrococcus Furiosus Protease I)肽酶家族,具有与PfpI高达90%的序列同源性,而PfpI是家族中少数的具有肽酶活力的成员之一。为进一步了解该酶结构和功能的关系以及相关的催化机制,我们应用基因工程及蛋白质工程等方法对其进行了较为系统的研究。(1)我们将嗜热蛋白酶PhpI的基因异源表达E.coli宿主中,成功构建了带有其基因的大肠杆菌工程菌。并通过western blotting和蛋白质N端测序确定了其基本的活性形式。(2)结构分析中发现,Tyr120位点与催化叁联体上的Cys100催化基团之间有主链氢键相互作用,并且Tyr120位点恰好位于底物口袋的入口处,因此我们构建了Y120S、Y120W和Y120P叁种不同的突变体改变底物口袋处的空间位阻,并分别探讨Tyr120位点侧链残基及主链氢键对于酶催化活性的作用。动力学数据表明,Y120P的催化活性明显提高,催化L-R-AMC的kcat值约是野生型的7倍;而催化L-AAFR-AMC的kcat则是野生型的10倍。揭示了Tyr120位点对于酶催化功能和底物结合能力的重要作用。(3)结构分析发现,113和129位点处于蛋白酶PhpI的别构部位并与阴离子结合,它们与120残基还处于同一loop区域。我们设计并测定了相关突变体的活力。结果发现R113A和R113T的活力增长十分显着,而N129A和N129D则降低了酶的活力,特别是N129D甚至无法水解内切酶底物L-AAFR-AMC。因此我们推测,113和129位点可能通过阴离子的结合使整个loop区域的结构发生微弱的变化,从而影响酶的催化活性。本研究为进一步探讨嗜热蛋白酶PhpI的催化反应调控机制奠定了基础。(本文来源于《吉林大学》期刊2010-05-01）
梁晓亮[5]（2010）在《嗜热蛋白酶WF146的抗自降解研究及其应用》一文中研究指出嗜热蛋白酶WF146是嗜热菌Bacillus spWF146分泌的一种丝氨酸蛋白酶,属于枯草杆菌蛋白酶家族(Subtilisin family)。该酶以前体形式合成,包含信号肽、N端前肽和成熟酶叁个部分,其中成熟酶部分含有一对二硫键(Cys52-Cys65)。蛋白酶WF146经过60℃保温处理后能自加工成熟,转变为32 kDa的成熟酶形式。该酶最适反应温度为85℃,最适pH为8.0左右,在10 mMCaCl2和10mMNaCl存在时60℃保温2h以上酶活力保持不变。在还原条件下或酶浓度较高时(大于5μg/ml)该酶会发生自降解,产生分子量分别为25kDa和7 kDa的两条降解带。蛋白酶WF146产生自降解的机制和抗自降解研究是本研究的重点。此外,我们还对该酶的抗自降解突变体N63P/A66P在处理角蛋白废弃物及朊蛋白污染方面的应用开展研究。首先,我们通过分子筛对自降解产物进行分离,并通过N末端测序确定了自降解的两个切点,分别为Asn63-Gly64和Cys65-Ala66。活性染色和酶活性测定结果发现自降解产物仍然保留催化能力。戊二醛交联和共复性实验表明自降解产生的N端肽段(FN)和C端肽段(FC)并未分离,是以复合体的形式存在的,从而保证了酶分子催化中心的完整性。虽然自降解复合物的活性与完整成熟酶相比没有显着变化,但是其稳定性有较大下降,这也正是自降解会导致酶整体稳定性下降的主要原因。从同源模拟的叁维结构上看,两个自降解位点均位于一个分子表面的环结构中。为了删除自降解位点,我们分别或同时在Asn63和Ala66引入刚性最强的氨基酸残基Pro。结果显示,突变体N63P、A66P和N63P/A66P在80℃的稳定性相比野生型酶都在不同程度上有所提高,其中双突N63P/66P不仅在还原条件下和非还原条件下的半衰期分别提高到野生型酶的2.8倍和2.2倍,而且在高温下(80℃)对可溶性底物(casein)及不可溶性底物(keratin azure)的降解能力也都有提高。这些结果表明,酶分子表面环局部结构的柔性较强是导致自降解发生的主要原因,增强局部结构的刚性可以减少甚至避免自降解的发生。角蛋白是一种广泛存在于动物毛发及表皮中的结构蛋白,富含大量二硫键和p-折迭结构,这些结构使其成为最难降解的蛋白之一。实验表明在80℃及还原剂存在的条件下N63P/A66P能在3h左右明显将完整羽毛降解,而要达到相同的降解程度蛋白酶K在50℃需要24h。另外,N63P/A66P还能在高温下水解PrPSc-like淀粉样朊蛋白纤维。实验结果表明抗自降解突变体N63P/A66P在处理角蛋白废弃物和医疗器械中有良好的应用潜力。为了获得大量有活性的重组蛋白酶便于今后的工业应用,我们将蛋白酶WF146克隆到分泌性表达宿主枯草芽胞杆菌和巴斯德毕赤酵母中。结果表明蛋白酶WF146成功的分别在枯草芽胞杆菌和巴斯德毕赤酵母中表达并分泌到胞外,表达量分别达到5μg/ml和50μg/ml。酵母中表达的重组蛋白酶被N-糖基化修饰,使野生型蛋白酶WF146的抗自降解能力有所提高。(本文来源于《武汉大学》期刊2010-04-01）
宋搏[6]（2009）在《嗜热蛋白酶PhpI分子克隆及突变体Y120P对酶学性质影响》一文中研究指出蛋白酶是一类重要的水解酶,它能催化蛋白质降解为多肽段和氨基酸,具有重要的生理功能,并在工业上有广泛的用途。基于其分布广、种类多的特点,发现新型蛋白酶,确定其分子作用机制及生物学意义成为重要的研究课题。超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii中的嗜热蛋白酶PhpI是一类新型的蛋白酶,它属于DJ-1/ThiJ/PfpI超家族。为了解该酶结构和功能的关系以及催化机制,我们应用分子生物学技术及蛋白质工程等方法对其进行了较为系统的酶学性质研究。我们将超嗜热蛋白酶PhpI的基因在常温菌E.coli中进行克隆表达,证明重组酶主要以十二聚体的形式存在。酶学性质分析发现:该蛋白酶的最适温度为80℃,最适pH为8.0,在pH 7.5-8.5范围内相对活力保持在80%以上;该蛋白酶对多种有机溶剂都具有较高的抗性;0.2%-5.0%的Tween-20和Triton X-100对酶有激活作用;该酶的底物作用谱宽,不仅对天然蛋白酶底物有水解活力,同时还具有氨基肽酶和内切酶的水解活力;稳态动力学分析表明其最适氨基肽酶底物为L-R-AMC,kcat/Km:0.052μM-1min-1;其最适内切酶底物为L-AAFR-AMC,kcat/Km:0.011μM-1min-1。晶体结构分析表明,天然酶的120位点处于底物结合口袋的入口处并与催化基团Cys100形成主链氢键,推测可能对酶催化有重要的影响。我们构建的突变体Y120P,既消除了天然酶在底物结合口袋入口处Tyr120侧链苯环的空间位阻,也破坏了主链氢键的形成。研究该位点对酶催化及底物选择性的影响时发现,Y120P在保持了对天然大分子底物的水解活力基础上,对短肽底物催化能力也有提高。动力学数据表明其催化L-R-AMC的kcat值约是野生型的7倍,Km基本没有变化;催化L-AAFR-AMC的kcat约是野生型的10倍,Km约为野生型的1/2。结合生物信息学分析发现:120位点突变为P后底物结合口袋的直径增加了3.7 ?,且打断了与Cys100的主链氢键作用,更有利于较大底物分子的结合和催化作用。本研究对深入了解这类新型半胱氨酸蛋白酶催化机制奠定了基础。(本文来源于《吉林大学》期刊2009-05-01）
张云峰[7]（2008）在《嗜热蛋白酶生产菌DPE7的16 S rRNA基因克隆及系统发育》一文中研究指出[目的]确定嗜热蛋白酶生产菌DPE7的系统发育地位。[方法]通过PCR方法扩增出嗜热蛋白酶生产菌DPE7的16 S rRNA基因片段,并对其进行了克隆和测序。[结果]对该序列在GenBank中的BLAST结果表明,相似性高于99%的序列中大部分是泥土芽胞杆菌的16 S rRNA基因序列,其中与Geobacillus toebii T1680的16 S rRNA基因序列相似性达99.60%。对菌株DPE7和其他13株泥土芽胞杆菌的16 S rRNA基因序列进行系统发育分析,菌株DPE7与其中的4株泥土芽胞杆菌聚类在一起。[结论]经16 S rRNA基因序列同源性比较和系统发育分析,确定菌株DPE7为泥土芽胞杆菌。(本文来源于《安徽农业科学》期刊2008年22期）
杨怡然,唐兵[8]（2007）在《嗜热蛋白酶WF146的成熟冷适应研究》一文中研究指出嗜热蛋白酶 WF146是一种最适温度为85℃的丝氨酸蛋白酶,己在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功表达及纯化。表达产物以可溶的无活性酶原形式存在,经过在60℃加热处理后,能在 N 端前肽协助下进行正确折迭、自加工,最终切除 N 端前肽转变为有活性的成熟酶,而在低温下酶原成熟过程缓慢。嗜冷酶 S41与 WF146蛋白酶具有67.1%的序列同一性。通过对 S41的 X 衍射晶体叁维结构分析比对,确定其底物结合区附近序列,并分为两个区域利用定点突变的方法与 WF146蛋白酶相应区域进行置换。引入嗜冷酶 S41底物结合区附近序列后,使 WF146蛋白酶酶原在较低温度下成熟速度明显增加。与突变前相比,含两个区域共七个氨基酸替换(S105G/G107D/Y117E/S136N/V143G/K144E/D145S)的突变体酶原在室温(25℃)下转变为成熟酶,并完全释放活性比野生型提前约10小时。比较野生型和突变体 WF146成熟酶热动力学参数 K_M、K_(cat)和 k_(cat)/K_M,还发现受底物结合区改变影响,自加工过程明显变快的突变体同时表现出改变的底物专一性。对大分子底物 casein 和蛋白质 BSA 的降解对比也与上述结果一致。通过研究来源于极端环境微生物的蛋白酶结构和功能,探索酶温度适应机制具有重要理论意义和应用价值。作为主要生物功能大分子,蛋白酶通常以酶原形式存在,不同条件下酶原折迭加工成熟与其功能和调控联系紧密。本研究模拟嗜冷酶 S41底物结合区附近序列,使嗜热蛋白酶 WF146在低温下自加工过程加快, 出现酶原成熟冷适应的现象。证明底物结合区的改变对 WF146蛋白酶成熟过程中前肽的自加工和释放有明显影响,提示前肽和底物结合区的相互作用对蛋白酶原的成熟有关键作用。(本文来源于《“环境与健康”学术研讨会论文摘要集》期刊2007-10-01）
王国惠[9]（2007）在《常温环境中产嗜热蛋白酶菌资源》一文中研究指出通过计数、分离与筛选,对常温环境嗜热菌和产嗜热蛋白酶菌的分布及资源状况进行了研究。结果表明,常温环境中存在着一定数量的嗜热菌和产嗜热蛋白酶菌。土壤与水体相比,其嗜热菌资源相对丰富,且耕作肥沃的土壤中产嗜热蛋白酶菌多于贫瘠土壤;在水环境中,无论湖水、江水还是处理中的废水,在常温条件下均有一定比例的嗜热菌和产嗜热蛋白酶菌。在啤酒废水曝气阶段,产嗜热蛋白酶菌占嗜热菌的比例较大,达45%。本研究筛选的1株嗜热菌其产嗜热蛋白酶活性较高,该菌株在pH7·6、温度68℃条件下其蛋白酶活力达到642U·ml-1。该项研究为开发产嗜热蛋白酶菌资源,在工业和环境治理等方面的应用提供重要科学依据。(本文来源于《生态学杂志》期刊2007年01期）
卞艳,梁晓亮,方楠,唐晓峰,唐兵[10]（2006）在《二硫键对嗜热蛋白酶WF146稳定性的影响》一文中研究指出本实验室分离到一株能够产生胞外蛋白酶的嗜热芽孢杆菌WF146,利用专一简并杂和引物PCR获得了WF146蛋白酶基因。在其基因3’端加入His-tag亲和标签后,其表达产物为含405个氨基酸残基的酶原形式,包括一段84个氨基酸残基的N端前肽部分和一段321个氨基酸残基的成熟酶部分。通过序列比对, WF146蛋白酶在一级结构上与嗜冷酶相似,但在理化性质上却表现为嗜热酶。该酶反应最适温度为85℃,60℃条件下保温很稳定。(本文来源于《第二届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文集》期刊2006-10-01）
嗜热蛋白酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
Subtilases (Subtilisin-like serine proteases,枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶)是广泛存在于细菌、古生菌以及真核生物中的一类丝氨酸蛋白酶,它在生物体的多种生理活动中发挥着重要的作用,例如蛋白质代谢、酶原活化等。Subtilases通常以无活性的前体形式合成,必须经历加工成熟过程才能转变为有活性的成熟酶,这种加工成熟的过程能够精确调节Subtilases活性的释放及功能的发挥。嗜热Subtilases是研究酶的温度适应机制的重要实验材料,同时也在工业应用上具有重大潜能,因而受到了人们的广泛关注。对适应不同温度的Subtilases的加工成熟过程的研究,不仅能帮助我们更好地理解它们的温度适应机制,同时也为在工业应用中制备有活性的Subtilases提供更多有价值的信息。嗜热蛋白酶WF146是来源于嗜热细菌Bacillus sp. WF146中的一种胞外Subtilases。它在细胞内以前体的形式合成,包括信号肽、N端前肽和成熟酶区叁部分。我们以大肠杆菌为宿主对WF146蛋白酶进行异源表达,产生的WF146蛋白酶酶原以可溶形式存在于细胞内。该酶原(43kDa)在60℃保温时,可以自加工去除N端前肽而转变为32kDa的成熟酶,说明重组酶原已经折迭为正确结构。本论文将在此基础上开展嗜热蛋白酶WF146加工成熟的分子机制研究。首先,我们研究了WF146蛋白酶可能的成熟途径,通过构建该酶活性位点突变体来捕捉成熟过程中可能存在的加工产物及中间体。研究结果显示：当WF146蛋白酶的活性位点Ser249突变为Ala后,该突变体丧失成熟的能力,表明活性位点是酶原去除N端前肽所必需,确定WF146蛋白酶酶原的自加工成熟过程依赖于其自身成熟酶区的活性；当活性位点Ser249突变为Cys后,WF146蛋白酶可以自加工为33kDa的中间体,但是不能进一步加工为成熟酶；当野生型酶原在有丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)存在的情况下于60℃保温时,我们观察到酶原成熟过程中有33kDa的中间体的积累。这些实验结果表明,WF146蛋白酶酶原在自催化(Auto-catalytic)成熟过程中经历了一个中间体阶段,在此过程中对N端前肽的加工采用的是两步加工机制。首先,N端前肽的主体部分(N*)被成熟酶区活性位点顺式加工(cis-processing),形成中间体；然后,N*与成熟酶区之间的连接肽段被截短,中间体转变为成熟酶。此外,WF146蛋白酶酶原的自催化成熟还能通过成熟酶对酶原中N*与成熟酶区之间的连接肽段进行反式加工(trans-processing)来进行。我们还发现,与大多数其他Subtilases不同,WF146蛋白酶的成熟过程除了可以依靠自身成熟酶区的活性来引发之外,也可以依靠外源蛋白酶的活性来引发。通过圆二色谱分析,我们发现WF146蛋白酶在加工成熟过程中发生细微结构调整。通过限量酶解实验,我们发现酶原中N端前肽部分对蛋白酶降解敏感,而成熟酶区则十分稳定,这一结构特点使得酶原可以通过反式加工去除N端前肽而完成成熟过程。其次,我们对Ca2+在WF146蛋白酶加工成熟过程中的作用进行了详细研究。WF146蛋白酶与嗜冷蛋白酶S41和嗜温蛋白酶Sphericase分别具有68%和67%的氨基酸序列一致性,后两种酶中均含有相同的五个Ca2+结合位点。通过氨基酸序列比对我们发现WF146蛋白酶至少含有四个与之相对应的Ca2+结合位点。Ca2+对WF146蛋白酶的活性、稳定性及加工成熟过程都具有重要作用。在螯合剂EDTA存在时,WF146蛋白酶酶原在60℃可以顺式加工为一种特殊的N端前肽-中间体复合物,这种中间体不能进一步加工为成熟酶,而是在降低温度或(和)加入Ca2+后能够与N端前肽重新连接为酶原。通过圆二色谱法分析,我们发现当除去溶液中的Ca2+后,WF146蛋白酶酶原的结构变得不稳定。这些结果说明,Ca2+具有维持WF146蛋白酶的结构稳定性的作用,酶原分子通过结合Ca2’形成稳定结构而保证加工成熟过程的顺利进行。最后,我们对WF146蛋白酶的N端前肽功能进行了研究,同时对它成熟过程中的两个加工位点间的连接肽段(12个氨基酸残基)进行了突变及功能分析。结果表明,WF146蛋白酶酶原中的N端前肽能够作为分子内伴侣协助成熟酶区正确折迭,同时也是成熟酶的活性抑制剂。WF146蛋白酶成熟过程中的两个加工位点间的连接肽段对N端前肽分子内伴侣及活性抑制剂功能没有影响。这段连接肽段中富含带负电荷的Glu残基(5个),将这5个Glu残基同时突变为其它类型的氨基酸残基(分别突变为Gln, Ala, Gly, Lys)后并未影响到成熟酶的性质,但是会使酶原成熟过程加快。当我们对连接肽段进行缺失突变后,WF146蛋白酶酶原的折迭及加工过程受到影响。我们推测该连接肽段在酶原的加工成熟过程中具有调节作用,保证该酶在合适的时间和位置释放活性,避免过早释放蛋白酶活性而对细胞造成损害。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
嗜热蛋白酶论文参考文献
[1].詹冬玲,高楠,韩葳葳,冯雁.嗜热蛋白酶PH1704别构中心量子化学计算与突变体动力学[J].高等学校化学学报.2014
[2].朱晖.嗜热蛋白酶WF146加工成熟的分子机制研究[D].武汉大学.2013
[3].詹冬玲,高楠,韩葳葳,冯雁.分子对接和动力学模拟提高嗜热蛋白酶PhpI的活力[J].高等学校化学学报.2013
[4].白鹤.定点突变探讨嗜热蛋白酶PhpI活性调控机制[D].吉林大学.2010
[5].梁晓亮.嗜热蛋白酶WF146的抗自降解研究及其应用[D].武汉大学.2010
[6].宋搏.嗜热蛋白酶PhpI分子克隆及突变体Y120P对酶学性质影响[D].吉林大学.2009
[7].张云峰.嗜热蛋白酶生产菌DPE7的16SrRNA基因克隆及系统发育[J].安徽农业科学.2008
[8].杨怡然,唐兵.嗜热蛋白酶WF146的成熟冷适应研究[C].“环境与健康”学术研讨会论文摘要集.2007
[9].王国惠.常温环境中产嗜热蛋白酶菌资源[J].生态学杂志.2007
[10].卞艳,梁晓亮,方楠,唐晓峰,唐兵.二硫键对嗜热蛋白酶WF146稳定性的影响[C].第二届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文集.2006
论文知识图
