海南传统发酵食品中益生乳杆菌的筛选及其对高脂血症预防机制研究

论文摘要

海南省地处中国最南端,热带微生物资源丰富,历代居住在海南岛上的居民拥有使用环境微生物生产各种发酵食品的丰富经验,海南传统发酵蔬菜和鱼茶作为备受海南人喜爱的传统发酵食品,自然成为了研究热带微生物多样性及有益微生物来源的最佳模型。前期,我们结合高通量测序及纯培养技术,对采集自海南省不同地区的36份发酵蔬菜及24份鱼茶样品进行了微生物多样性分析,并对其中的有益微生物进行了分离鉴定。结果表明,在属的水平上,乳杆菌属（Lactobacillus）是海南传统发酵食品中含量最丰富的属,且Lactobacillus plantarum存在于每个地区的发酵食品中,含量最高,为海南传统发酵食品中的优势菌种。基于微生物群落α和β多样性的分析结果表明,不同地区鱼茶样品间的微生物群落结构差异显著,不同蔬菜种类对于发酵蔬菜微生物群落结构的影响大于地域的影响。从PICRUSt预测的微生物功能特征来看,海南传统发酵食品中微生物代谢通路十分丰富,微生物代谢趋于活跃。结合纯培养技术,我们共从海南传统发酵食品中筛选出500株乳酸菌菌株（发酵蔬菜353株,鱼茶147株）,通过耐酸、耐胆盐性能测试,初步筛选出一株性能良好的植物乳杆菌,命名为Lactobacillus plantarum HNU02,并对其进行了全基因组学测序。通过对其完整基因组序列的解读及其生理功能方面的表征,充分表明其具有作为益生菌的巨大潜力。高脂血症是一种典型的慢性疾病,是机体脂代谢失常或运转异常而导致的血浆或血清中脂质水平过度升高的一种病症,可诱发多种心血管疾病。作为一种代谢性疾病,高脂血症的发生与肠道菌群的代谢紊乱密切相关。由于药物治疗高脂血症的副作用及成本相对较高,研究人员目前已将重点转移到以宿主的肠道菌群作为高脂血症治疗的靶点。虽有研究已报道了肠道菌群和高脂血症之间的关系,但由益生菌所引起的与预防高脂血症相关的肠道菌群及其代谢物的变化目前尚不清楚。本研究应用荧光定量PCR技术结合基于高通量测序的宏基因组学技术,对30只6周龄的Sprague-Dawley大鼠进行了为期8周的实验（对照组:常规饮食,n=8;高脂血症组:高脂饮食,n=8;益生菌组:高脂饮食+1 g含10s CFU/g的Lactobacillus planrum HNU082菌粉,0-28天）。结果表明,益生菌组大鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量高于高脂血症组,甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量显著低于高脂血症组,且Lactobacillus plantarum HNU082能够在大鼠肠道内定殖至少8周以上。基于UniFrac距离的主坐标分析表明,高脂血症组大鼠的肠道菌群结构发生了显著改变,Lactobacillus plantarum HNU082的摄入调节了高脂血症大鼠肠道菌群结构的偏差。在属的水平上,益生菌组中双歧杆菌属（Bifidobacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus）、栖粪杆菌属（Faecalibacterium）和Akkermansia含量显著增加,高脂血症组中梭菌属（Clostiridium）、Natranaerovirga和Odoribacter含量显著增加。基于代谢通路的进一步分析结果显示,益生菌组和对照组大鼠的肠道中富含丙酮酸代谢、甘油脂代谢、丙酸代谢和脂肪酸生物合成代谢,而高脂血症组大鼠肠道中富含次级胆汁酸和脂多糖生物合成代谢。通过构建肠道菌群、血液指标、代谢通路以及Lactobacillus plantarum HNU082之间的相关性网络图,我们更加直观的观察到了Lactobacillus plantarum HNU082预防高脂血症的潜在机制。最终我们认为,Lactobacillus plantarum HNU082能够通过影响宿主肠道微生物群落,引发微生物功能代谢调节,进而调节宿主的血液生理指标,达到预防高脂血症的目的。本研究将有助于更好的理解益生菌在高脂血症预防过程中的作用机制,并为含有益生菌功能性食品的设计和应用提供新的见解和思路。

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摘要

Abstract

1 引言

1.1 发酵食品

1.1.1 发酵食品的概述

1.1.2 发酵食品中的乳酸菌

1.2 高通量测序

1.2.1 宏基因组

1.2.2 全基因组

1.3 益生菌

1.3.1 益生菌的起源

1.3.2 益生菌的生理功能

1.3.3 益生菌的作用机理

1.4 高脂血症

1.4.1 高脂血症的概述

1.4.2 高脂血症的危害

1.4.3 高脂血症的治疗

1.5 研究的目的、意义及主要内容

1.5.1 研究目的及意义

1.5.2 研究的主要内容

2 材料与方法

2.1 实验材料及仪器

2.1.1 实验原料

2.1.2 实验动物

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器与设备

2.1.5 培养基配方

2.2 实验方法

2.2.1 海南传统发酵食品的采集

2.2.2 海南传统发酵食品的理化指标测定

2.2.3 海南传统发酵食品中宏基因组DNA的提取、PCR扩增及高通量测序

2.2.4 海南传统发酵食品中乳酸菌的分离鉴定

2.2.5 菌株的冻存

2.2.6 菌株的耐酸能力测定

2.2.7 菌株的耐胆盐能力测定

2.2.8 全基因组测序

2.2.9 高脂血症大鼠模型的建立

2.2.10 大鼠粪便及血液样品的收集

2.2.11 大鼠血脂四项的测定

2.2.12 Lactobacillus plantarum HNU082特异性引物的设计

2.2.13 大鼠粪便样品中宏基因组DNA的提取

2.2.14 Lactobacilluss plantarum HNU082在宿主肠道中的定量

2.2.15 大鼠粪便样品的PCR扩增及高通量测序

2.2.16 生物信息学和统计学分析

3 结果与分析

3.1 海南鱼茶的微生物多样性

3.1.1 鱼茶样品信息及α多样性

3.1.2 鱼茶样品中微生物组成及核心微生物

3.1.3 不同地区鱼茶样品间差异性微生物

3.1.4 不同地区鱼茶样品间功能特征丰度比较

3.1.5 鱼茶样品中核心微生物对代谢功能特征的贡献率

3.1.6 鱼茶样品中核心微生物与代谢功能特征的相关性分析

3.1.7 鱼茶样品中乳酸菌菌株的分离鉴定

3.2 海南发酵蔬菜的微生物多样性

3.2.1 发酵蔬菜样品信息及测序情况

3.2.2 发酵蔬菜中微生物的α多样性

3.2.3 不同地区发酵蔬菜的微生物多样性

3.2.4 发酵蔬菜中核心微生物及其相关性

3.2.5 发酵蔬菜中微生物群落结构分析

3.2.6 不同种类发酵蔬菜间差异性微生物菌属/种

3.2.7 不同种类发酵蔬菜间代谢通路丰度比较

3.2.8 发酵蔬菜中核心微生物对代谢通路的贡献率

3.2.9 发酵蔬菜采集地地理因素、样品理化指标、菌群及代谢通路的相关性

3.2.10 发酵蔬菜中乳酸菌菌株的分离鉴定

3.3 具有潜在益生特性乳酸菌的筛选

3.3.1 耐酸、耐胆盐性能测定

3.3.2 Lactobacillus plantarum HNU082的全基因组测序

3.4 Lactobacillus plantarum HNU082与高脂血症预防机制的相关性

3.4.1 各实验组大鼠血脂四项的测定

3.4.2 Lactobacillus plantarum HNU082在大鼠肠道中的定殖能力

3.4.3 各实验组大鼠肠道群落结构相似度分析

3.4.4 各实验组大鼠肠道菌群的差异性微生物

3.4.5 各实验组大鼠代谢通路水平上的差异

3.4.6 Lactobacillus plantarum HNU082、菌群、血液指标及代谢通路的相关性

4 讨论

4.1 海南传统发酵食品中微生物多样性分析

4.1.1 海南鱼茶的微生物多样性

4.1.2 海南发酵蔬菜的微生物多样性

4.2 具有潜在益生特性乳酸菌的筛选

4.3 Lactobacillus plantarum HNU082与高脂血症预防机制的相关性

5 结论

参考文献

附录

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 彭倩楠

导师: 张家超

关键词: 海南传统发酵食品,植物乳杆菌,肠道菌群,高脂血症,高通量测序

来源: 海南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 海南大学

分类号: TS201.3

DOI: 10.27073/d.cnki.ghadu.2019.000035

总页数: 66

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海南传统发酵食品中益生乳杆菌的筛选及其对高脂血症预防机制研究

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