董枫[1]2011年在《妊娠早期不明原因自然流产患者绒毛及蜕膜组织血管增殖及细胞凋亡的研究》文中研究表明目的:探讨血管增殖相关因子胎盘生长因子(PLGF)和可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)及细胞凋亡相关因子半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)在早期不明原因自然流产患者绒毛和蜕膜组织中的表达情况;同时分析绒毛和蜕膜细胞的细胞凋亡情况。方法:选择30例不明原因早期自然流产患者(不明原因流产组)、30例早期药物流产患者(药物流产组)和30例正常早期妊娠妇女要求人工流产者(人工流产组)为研究对象,分别收集其绒毛及蜕膜组织。采用DNA缺口原位末端标记技术(TUNEL法)检测绒毛滋养细胞和蜕膜细胞的细胞凋亡情况;采用免疫组织化学SP法检测叁组绒毛和蜕膜组织中Caspase-3、PLGF和sFlt-1的表达水平。结果:1. Caspase-3、PLGF和sFlt-1在绒毛和蜕膜组织中的表达部位:Caspase-3主要在绒毛组织中的细胞滋养细胞和蜕膜组织中的蜕膜细胞中表达,为棕黄色颗粒,在细胞核和细胞浆中同时表达;PLGF和sFlt-1主要表达于绒毛滋养细胞和蜕膜细胞,表达部位在细胞浆,亦为棕黄色颗粒。2. Caspase-3和sFlt-1在叁组绒毛和蜕膜组织中的表达情况:Caspase-3和sFlt-1在叁组绒毛滋养细胞和蜕膜细胞中的表达差异有统计学意义(P均<0.01)。经两两比较,Caspase-3在不明原因流产组绒毛(0.426±0.044)和蜕膜(0.418±0.052)组织中的表达强度显着高于药物流产组(0.281±0.051 , 0.287±0.041)和人工流产组(0.304±0.041 ,0.311±0.034),P均<0.05;sFlt-1在不明原因流产组绒毛(0.432±0.042)和蜕膜(0.436±0.044)组织中的表达强度也显着高于药物流产组(0.299±0.041,0.292±0.039)和人工流产组(0.281±0.044,0.277±0.035),P均<0.05;而药物流产组绒毛和蜕膜组织中Caspase-3和sFlt-1表达强度与人工流产组比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。3. PLGF在叁组绒毛和蜕膜组织中的表达情况:PLGF在叁组绒毛和蜕膜组织细胞中的表达差异均有统计学意义(P均<0.01)。经两两比较,不明原因流产组绒毛(0.321±0.035)和蜕膜(0.318±0.022)组织PLGF表达强度显着低于药物流产组(0.414±0.046,0.447±0.044)和人工流产组(0.405±0.029,0.412±0.034),P均<0.05;药物流产组绒毛和蜕膜组织PLGF表达强度与人工流产组比较差异无统计学意义(P>0.05)。4.绒毛及蜕膜细胞凋亡状况:经过TUNEL染色后,绒毛及蜕膜细胞核呈棕黄色或黄色者为凋亡细胞。凋亡在叁组绒毛和蜕膜细胞中的表达情况:其表达的差异有统计学意义(P <0.01)。经两两比较,不明原因流产组绒毛(50.166±5.180)%和蜕膜(48.668±4.482)%细胞的凋亡指数显着高于药物流产组(19.166±4.169)%、(18.433±3.945)%和人工流产组(18.000±4.000)%、(18.400±3.719)%,差异有统计学意义(P均<0.05) ;药物流产组和人工流产组绒毛和蜕膜细胞的凋亡指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.早期不明原因自然流产的发生可能与胎盘绒毛过度凋亡有关,其中caspase-3表达增加可能在凋亡的发生中起重要作用。2.早期不明原因自然流产的发生可能与PLGF表达不足和sFlt-1表达增加导致绒毛和蜕膜血管增殖异常有关。
侯震晖[2]2004年在《不明原因早期自然流产体外反应体系中蜕膜淋巴细胞增殖和绒毛滋养细胞凋亡》文中进行了进一步梳理目的 探讨不明原因早期自然流产的母胎免疫异常与发病的关系。方法 分别提取,纯化和(或)培养正常和自然流产蜕膜淋巴细胞和绒毛滋养细胞,进行混合反应(共4组)120h,以MTT比色法检测每组蜕膜淋巴细胞增殖能力;以流式细胞术检测每组绒毛滋养细胞的凋亡情况。并将所得数据进行组间比较。结果正常妊娠滋养细胞与自然流产蜕膜淋巴细胞混合组的淋巴细胞增殖和滋养细胞凋亡率均高于自然流产滋养细胞与正常妊娠蜕膜淋巴细胞混合组。结论母体蜕膜局部免疫微环境功能紊乱(蜕膜淋巴细胞增殖活性升高)而导致的免疫损伤(滋养细胞凋亡增加)是不明原因早期自然流产的母胎免疫异常的主要原因。
张钰[3]2010年在《复发性流产的病因分析及其与趋化因子CXCL12、CCL2、RANTES表达异常的研究》文中进行了进一步梳理复发性流产(Recurrent Spontaeous Abortion, RSA)是指连续发生2次或2次以上的自然流产,发病率约占育龄夫妇的5%。RSA的病因复杂,排除临床上可查出的病因,仍有近1/2的RSA患者的病因未明,称为不明原因复发性流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion URSA),是临床上难治性的不育症。第一部分反复性自然流产病因分析目的：探讨RSA患者的临床病因。方法：对74对RSA夫妇进行规范化病因筛查,包括夫妇染色体核型分析、生殖道解剖结构检查、内分泌激素检查、生殖道感染因素检查以及自身免疫抗体检测,以分析RSA的病因、建立RSA病因筛查的临床路径。结果：在74对RSA夫妇中,染色体异常6例,占8.1%；生殖道解剖异常4例,占5.4%；内分泌异常13例,占17.6%；生殖道感染5例,占6.8%；免疫异常46例,占62.1%,其中自身免疫异常14例,占18.9%；同种免疫异常(不明原因)32例,占43.2%。结论：RSA病因复杂,包括染色体异常,生殖道解剖结构异常,内分泌代谢异常,生殖道感染,免疫异常等因素。免疫因素在RSA的病因中占重要地位,免疫异常中约有2/3原因不明,临床上称为URSA。病因学的探讨以及针对病因进行预防性治疗是防治RSA的关键。第二部分趋化因子CXCL12、CCL2、RANTES表达异常与URSA发病的关系目的：探讨URSA患者绒毛、蜕膜基质细胞衍生因子(CXCL12)、单核细胞趋化蛋白-1(CCL2)、调节活化正常T细胞表达和分泌的因子(RANTES)-mRNA表达异常和血清CXCL12、CCL2、RANTES水平变化与URSA发病的关系。方法：收集URSA患者26例(URSA组)和正常早孕妇女30例(对照组)的绒毛、蜕膜和血清标本,应用实时荧光PCR方法检测两组绒毛、蜕膜CXCL12、CCL2、RANTES-mRNA的表达,应用ELISA方法检测两组血清CXCL12、CCL2、RANTES的蛋白含量。结果：1)人早孕绒毛、蜕膜组织均有趋化因子CXCL12、CCL2、RANTES-mRNA表达。2)URSA组绒毛、蜕膜组织CXCL12-mRNA的表达量为(0.46±0.15,0.35±0.13),均较对照组(1.79±0.82,0.81±0.21)显着降低(P<0.01)：CCL2-mRNA的表达量为(1.99±0.35,2.77±0.61),均较对照组(1.42±0.28,1.90±0.85)显着升高(P<0.01)；RANTES-mRNA的表达量为(1.40±0.25,2.25±0.33),均较对照组(0.94±0.22,1.45±0.20)显着升高(P<0.01)。3)URSA组血清CXCL12的蛋白含量为(94.52±29.23pg/ml),对照组为(268.13+26.36pg/ml),两组相比,差异有显着性(P<0.01)；CCL2的蛋白含量为(83.34±10.61pg/ml),对照组为(59.41±9.70pg/ml),两组相比,差异有显着性(P<0.01)；RANTES的蛋白含量为(117.29±18.67pg/ml),对照组为(79.88±12.54pg/ml),两组相比,差异有显着性(P<0.01)。4)两组血清CXCL12值与绒毛、蜕膜CXCL12-mRNA表达量呈正相关,相关系数分别为0.723,0.604(P均<0.01)；CCL2值与绒毛、蜕膜CCL2-mRNA表达量呈正相关,相关系数分别为0.595,0.655(P均<0.01)；RANTES值与绒毛、蜕膜RANTES-mRNA表达量呈正相关,相关系数分别为0.482,0.675(P均<0.01)。结论：CXCL12、CCL2、RANTES表达于人早孕绒毛和蜕膜组织中,参与母胎界面绒毛滋养细胞和蜕膜免疫活性细胞功能的调控；绒毛、蜕膜组织CXCL12低表达,CCL2、RANTES高表达与URSA的发病机制有关；血清CXCL12、CCL2、RANTES在胚胎停育的早期诊断中具有重要的临床意义。第叁部分：米非司酮对早孕绒毛、蜕膜趋化因子CXCL12、CCL2、RANTES表达的影响目的：探讨孕激素受体拮抗剂米非司酮对早孕绒毛、蜕膜组织趋化因子CXCL12、CCL2、RANTES表达的影响。方法：收集服用米非司酮48小时后清宫的正常早孕妇女30例(米非司酮组)的绒毛、蜕膜标本,应用实时荧光PCR方法检测米非司酮组绒毛、蜕膜CXCL12、CCL2、RANTES-mRNA的表达,并与对照组比较。结果：米非司酮组绒毛、蜕膜组织CXCL12-mRNA的表达量为(0.59±0.22,0.42±0.17),均较对照组显着降低(P<0.01)；CCL2-mRNA的表达量值为(1.84±0.35,3.01±0.62),均较对照组显着升高(P<0.01)；RANTES-mRNA的表达量为(1.33±0.22,2.17±0.49),均较对照组显着升高(P<0.01)。结论：米非司酮通过影响早孕绒毛、蜕膜趋化因子CXCL12、CCL2、RANTES-mRNA的表达,破坏母胎界面免疫耐受机制而发挥其抗早孕作用。
刘俐伶[4]2009年在《绒毛蜕膜组织中白血病抑制因子表达水平与稽留流产的相关性研究》文中研究指明目的:在检测正常早孕及稽留流产患者绒毛蜕膜组织白血病抑制因子(LIF)表达水平的基础上,着重探讨白血病抑制因子表达与稽留流产的相关性,初步明晰白血病抑制因子在妊娠以及胚胎发育中的作用。通过检测正常早孕及稽留流产患者的人绒毛膜促性腺激素(β-hcG)及血清孕酮(P)水平,了解两组激素水平有无差异。通过比较β-hcG及P在两组的变化与LIF在两组的变化之间有无相关性,从而试图探讨β-hcG、P及LIF与稽留流产的相关性。方法:选择正常早孕患者25例与稽留流产患者35例,采用免疫组化技术—链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接法(SP法),对两组绒毛蜕膜组织中白血病抑制因子(LIF)进行组织学定位观察,并通过病理图像分析仪对其表达强弱度进行平均光密度值(IOD)测量,同时采用放射免疫法检测两组血清样本人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)及孕酮(P)水平。结果:(1)正常早孕组与稽留流产组血清P及β-hCG水平分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.01)。(2)2组患者组织中LIF均呈现阳性表达,绒毛组织阳性染色主要位于滋养细胞胞质中,胞核无明显着色。蜕膜组织的腺体和内膜细胞染色较明显,而间质无明显着色。(3)正常早孕组LIF表达呈阳性、稽留流产组LIF表达呈弱阳性,两组表达强度比较,差异有统计学意义(P＜0.01)。(4)正常早孕组中LIF在绒毛及蜕膜中的表达强度差异无统计学意义。稽留流产组中LIF在绒毛及蜕膜中的表达强度差异无统计学意义(P＞0.05)。结论:绒毛、蜕膜组织中白血病抑制因子(LIF)低表达以及人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)及孕酮(P)水平降低,在稽留流产的发生机制中扮演重要角色,也提示LIF对妊娠的正常维持有一定的保护作用。
李明清[5]2010年在《CD82在人早孕期母—胎界面的调节作用》文中研究指明母-胎界面滋养细胞具有独特的类似于肿瘤细胞的生物学行为,即高增殖和侵袭能力。滋养细胞增殖与侵袭对于囊胚植入、胎盘发育,并建立恰当的母-胎关系至关重要。滋养细胞增殖与侵袭功能障碍是子痫前期、胎儿宫内生长受限(FGR)、自然流产等妊娠相关疾病的主要原因。但在正常妊娠,滋养细胞很少发生无限制增殖和远处转移,提示可能受到细胞间直接或间接的分子调控,使其促侵袭和抑制侵袭维持生理性动态平衡。母-胎界面微环境细胞与分子间的相互作用可以调节滋养细胞侵入子宫内膜及蜕膜。因此,母-胎界面参与调控滋养细胞侵袭力的关联分子,可以影响胚泡的正常植入和生长。CD82蛋白是一种广泛表达的Tetraspanin超家族跨膜糖蛋白,是经典的肿瘤细胞侵袭抑制基因。已有研究证实CD82是细胞迁移的一个重要调节蛋白,CD82低表达与肿瘤细胞的侵袭和转移相关,致使多种晚期恶性肿瘤的不良预后。因此我们推测CD82可能参与母-胎界面滋养细胞侵袭能力的调控；解析CD82在母-胎界面的作用机制,及解析调控CD82表达的相关蛋白和基因将有助于阐明生理状态下胚泡植入和病理性滋养细胞疾病的发病机制,对治疗滋养细胞疾病亦具有潜在的临床应用价值。本研究在前期工作基础上,进一步关注CD82作用于人早孕期滋养细胞的分子机制,拟阐明CD82对滋养细胞功能调控的分子机制；CD82表达调控,及其在母-胎界面促进滋养细胞和蜕膜基质细胞交叉对话,调节滋养细胞侵袭能力的分子机制。目的分析CD82在正常和早期妊娠失败母-胎界面的表达及其表达调控。方法收集人早孕期正常或不明原因自然流产的绒毛与蜕膜组织,应用本实验室建立的胰酶消化、密度梯度离心法分离、培养正常人早孕期滋养细胞和蜕膜基质细胞(DSCs)。采用RT-PCR、定量real-time RT-PCR、免疫组织化学、免疫细胞化学和传统免疫印迹杂交法,分别检测母-胎界面CD82的表达,比较分析CD82在正常早孕与早期妊娠失败母-胎界面的表达差异。对原代培养的蜕膜基质细胞进行多种干预,包括妊娠相关激素和炎性介质,用in-cell Western检测蜕膜基质细胞CD82的表达。结果原代蜕膜基质细胞转录、翻译CD82；而原代滋养细胞不转录和翻译CD82。从mRNA和蛋白水平分析蜕膜组织中CD82的表达水平,发现正常早孕期蜕膜明显低于早期妊娠失败的蜕膜。生理浓度范围hCG能下调蜕膜基质细胞表达CD82(以10kU/L浓度作用最佳)；单独生理浓度孕激素和17β雌二醇对蜕膜基质细胞表达CD82无明显调节作用；但孕激素可以协同hCG进一步下调蜕膜基质细胞表达CD82。LPS促进蜕膜基质细胞表达CD82; IL-1β中和性抗体能拮抗LPS对蜕膜基质细胞表达CD82的促进作用。结论CD82在人早孕期母-胎界面蜕膜基质细胞表达,明显低于早期妊娠失败蜕膜,提示母-胎界面CD82异常表达可导致妊娠失败。hCG下调蜕膜基质细胞表达CD82,提示CD82与正常妊娠有关,并可能参与控制滋养细胞疾病的发生、发展；LPS通过刺激炎性介质IL-1β的分泌,上调CD82的表达,提示CD82可介导炎症导致的自然流产。目的解析CD82在人早孕期母-胎界面的生物学功能。方法原代培养人早孕期蜕膜基质细胞和滋养细胞,利用siRNA干扰技术,成功沉默蜕膜基质细胞CD82的表达,并建立直接或间接共培养体系；利用质粒pCNA3.1(+)-CD82转染滋养细胞肿瘤细胞系BeWo,成功实现BeWo细胞过表达CD82。蜕膜基质细胞经沉默CD82后,与原代滋养细胞共培养,此后采用Matrigel侵袭试验分析滋养细胞的侵袭力。分析BeWo细胞经转染CD82后的侵袭力；分别用定量real-time RT-PCR、in-cell Western和免疫荧光法分析蜕膜基质细胞沉默CD82后,及BeWo细胞过表达CD82后,侵袭相关分子的mRNA和蛋白表达水平。结果蜕膜基质细胞经CD82沉默后,与原代滋养细胞共培养,使滋养细胞侵袭力明显增强；蜕膜基质细胞表达TIMP1明显下调,integrinβ1和integrinavP3表达明显上调；而MMP2、MMP9、TIMP2和titin表达无明显改变。相反,转染CD82的BeWo细胞侵袭力明显减弱,TIMP1表达明显上调,integrinβ1和integrinαvβ3表达明显下调；同样,MMP2、MMP9、TIMP2和titin表达无明显差异。结论蜕膜基质细胞表达CD82或滋养细胞过表达CD82均可控制滋养细胞的侵袭力,通过升调节TIMP1表达,实现滋养细胞与蜕膜基质细胞的交叉对话。目的探讨CD82调节人滋养细胞侵袭性的信号通路。方法应用siRNA转染蜕膜基质细胞沉默CD82的表达；质粒转染BeWo细胞过表达CD82,然后分析沉默及过表达CD82对侵袭相关的关键信号通路分子表达的调控作用。为了分析CD82抑制滋养细胞侵袭能性的信号通路,建立蜕膜基质细胞和原代滋养细胞共培养体系,及BeWo细胞单独培养体系,分别加入integrinβ1中和性抗体或MAPK/ERK信号通路阻断剂U0126,用Matrigel侵袭试验分析各组滋养细胞的侵袭力,以解析integrinβ1和MAPK/ERK1/2信号通路在CD82调节人早孕期滋养细胞侵袭中的作用；继而用in-cell Western分析各组TIMP1蛋白表达水平。结果在蜕膜基质细胞与原代滋养细胞共培养系统中,蜕膜基质细胞经沉默CD82后,使滋养细胞侵袭力明显增加,pERK1/2与总ERK1/2的比值明显升高,integrinβ1表达明显增加,TIMP1表达明显下降；而integrinβ1中和性抗体和U0126则明显降低滋养细胞的侵袭力,能逆转CD82沉默对滋养细胞侵袭力的增强作用,解除对磷酸化ERK1/2的升调节作用,提示蜕膜基质细胞表达CD82通过抑制integrinβ1/MAPK/ERK1/2信号通路,控制人早孕期滋养细胞侵袭。integrinβ1中和性抗体和U0126处理也能有效逆转CD82对TIMP1表达的升调作用。同样,转染CD82的BeWo细胞经integrinβ1中和性抗体和U0126处理也呈现类似效果。TIMP1的表达水平与滋养细胞细胞的侵袭力呈直线负相关。结论因此,CD82主要通过抑制integrinβ1/MAPK/ERK1/2信号通路,促进人早孕期蜕膜基质细胞表达TIMP1,上调的TIMP1依次抑制滋养细胞的侵袭能力。目的分析人早孕期母-胎界面SDF-1/CXCR4对CD82表达调节作用。方法收集人早孕期正常蜕膜和绒毛组织,对原代蜕膜基质细胞进行多种干预,包括原代滋养细胞培养上清、重组人SDF-1、重组人CCL2、抗人SDF-1、CXCR4、CCL2中和性抗体或CCR2拮抗剂。用in-cell Western检测蜕膜基质细胞CD82的表达。同时建立蜕膜基质细胞和原代滋养细胞共培养体系,同时引入抗人CXCR4中和性抗体,Matrigel侵袭试验分析共培养体系滋养细胞的侵袭力。结果滋养细胞培养上清促进蜕膜基质细胞表达CD82；重组人SDF-1亦促进蜕膜基质细胞表达CD82; SDF-1或CXCR4中和性抗体可抑制滋养细胞上清对蜕膜基质细胞表达CD82的升调节作用。CXCR4中和性抗体直接处理滋养细胞明显降低其侵袭力；但CXCR4中和性抗体预处理蜕膜基质细胞后,共培养体系中滋养细胞的侵袭力明显增加；CXCR4中和性抗体分别预处理滋养细胞和蜕膜基质细胞后,共培养体系的滋养细胞侵袭力降低。此外,CXCR4中和性抗体预处理蜕膜基质细胞可以解除CD82对滋养细胞侵袭力的抑制作用。结论人早孕期母-胎界面滋养细胞分泌SDF-1,通过白分泌方式促进自身侵袭；通过旁分泌升调节蜕膜基质细胞表达CD82,控制滋养细胞的过度侵袭,使其侵袭力维持在正常适度范围,借此介导母-胎界面滋养细胞与蜕膜基质细胞的交叉对话。目的分析CsA调控母-胎界面CD82表达和滋养细胞侵袭力的分子机制。方法收集人早孕期正常蜕膜和绒毛组织,用CsA处理原代蜕膜基质细胞,或滋养细胞经CsA预处理后收获培养上清；用抗人SDF-1或CXCR4中和性抗体处理蜕膜基质细胞,然后用in-cell Western检测蜕膜基质细胞CD82的表达。于滋养细胞和蜕膜基质细胞的单独和共培养体系加入CsA, ELISA法分析培养上清中SDF-1的分泌；用抗人CXCR4中和性抗体分别预处理蜕膜基质细胞和/或滋养细胞后,然后进行共培养,在加入CsA后,Matrigel侵袭试验分析共培养体系滋养细胞的侵袭力。结果CsA对蜕膜基质细胞表达CD82无直接调节作用；但CsA能加强滋养细胞上清对蜕膜基质细胞表达CD82的促进作用；低浓度CsA能促进滋养细胞和共培养体系SDF-1的分泌；抗人SDF-1或CXCR4中和性抗体能抑制CsA通过滋养细胞对蜕膜基质细胞表达CD82的间接促进作用。在加入CsA的共培养体系中,抗人CXCR4中和性抗体预处理蜕膜基质细胞可以部分逆转CD82对滋养细胞侵袭力的抑制作用。结论CsA促进滋养细胞分泌SDF-1,放大人早孕期母-胎界面滋养细胞对蜕膜基质细胞表达CD82的促进作用；CD82进而抑制滋养细胞侵袭能力。因此,CsA可协调母-胎界面滋养细胞与蜕膜基质细胞之间的交叉对话。综上所述,本研究发现CD82对人早孕期母-胎界面具有多重调节作用：(1)通过抑制integrinβ1/MAPK/ERK1/2信号通路促进TIMP1表达,抑制滋养细胞侵袭；(2)蜕膜基质细胞通过表达CD82,控制滋养细胞过度侵袭；(3)蜕膜基质细胞CD82过表达可导致早期妊娠失败；(4)滋养细胞通过分泌SDF-1促进蜕膜基质细胞表达CD82,促进人早孕期母-胎界面滋养细胞和蜕膜基质细胞之间的交叉对话,适度控制滋养细胞侵袭能力；(5)CsA通过促进滋养细胞分泌SDF-1,升调节蜕膜基质细胞表达CD82,参与滋养细胞侵袭能力的精密调控。此外,人早孕期母胎界面CD82的表达还受妊娠相关激素的调控。本研究为完善滋养细胞侵袭调控机制,及临床治疗反复自然流产等相关妊娠疾病提供了新策略与新思路。
季玉琴[6]2010年在《EPO在人早孕期母—胎界面的功能调节》文中研究指明目的观察促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)及其受体(Erythropoietin Receptor,EPOR)在人早孕期母-胎界面的功能调节,及其异常表达在自然流产发生中的作用和可能信号通路。方法收集正常早孕期或自然流产的绒毛与蜕膜组织各20例,采用免疫组织化学、RT-PCR、Western Blot检测EPO、EPOR及HIF-1α的表达,并采用Western Blot分析下游信号分子STAT5、p38、JNK、ERK、AKT的活化情况。并通过体外研究,在绒外滋养细胞系HTR-8/SVneo和原代培养的蜕膜基质细胞的培养基中加入不同浓度的抗人EPO抗体中和EPO的作用,检测滋养细胞侵袭能力以及滋养细胞和蜕膜基质细胞的细胞活力、增殖和凋亡。结果EPO及EPOR在人早孕期母-胎界面的绒毛滋养细胞、蜕膜基质细胞及腺上皮细胞均有较强的表达;无论在mRNA,还是在蛋白水平,自然流产较正常早孕组表达水平显着降低(p<0.05)。进一步分析STAT5、p38、JNK、ERK、AKT的活化情况发现,自然流产的绒毛和蜕膜抗凋亡因子STAT5活化明显低于正常早孕组织(p<0.01);但JNK、ERK、AKT在两组间无显着差异(p>0.05)。自然流产组织中促凋亡因子p38的活化显着高于正常早孕组织(p<0.01)。正常早孕绒毛和蜕膜组织中HIF-1α表达较高;而自然流产组织中表达较低(p<0.05)。抗人EPO中和抗体能以剂量依赖的方式抑制滋养细胞的侵袭能力,也能以时间和剂量依赖方式抑制滋养细胞和蜕膜基质细胞的细胞活力和增殖能力,且显着促进这两种细胞的凋亡。结论EPO及EPOR在正常早期妊娠的母-胎界面高表达可能参与维持正常妊娠;表达下降则导致自然流产的发生。在正常早孕母-胎界面,EPO下游抗凋亡因子STAT5活化,并抑制促凋亡因子p38的活化;而EPO对STAT5和p38的调控异常,则导致滋养细胞及蜕膜基质细胞凋亡,最终导致妊娠失败。HIF-1α作为EPO上游调节因子,在正常妊娠绒毛和蜕膜组织较高表达;而HIF-1α表达下降,可能影响EPO在母-胎界面的调节作用,导致妊娠失败。我们的体外研究进一步证实,在早孕期母-胎界面EPO能调控滋养细胞和蜕膜基质细胞的生物学行为,参与早孕胎盘形成。
邵珺[7]2008年在《KAI1/CD82在人早孕期母—胎界面的表达及其对滋养细胞侵袭性的调节作用》文中提出正常妊娠类似于成功的同种异体移植,母体对携带父系抗原的胚胎不仅不排斥,而且允许胎儿在子宫内生长发育直至分娩;这一过程有赖于独特的母-胎界面免疫微环境,以及母体对胚胎抗原的免疫耐受状态的建立和维持;同时还需要母-胎界面生物学功能的精密调控,特别是滋养细胞的生长及侵袭能力在正常早期妊娠的维持中至关重要;否则可能导致妊娠失败,从而发生自然流产。KAI1/CD82是多种肿瘤中普遍表达的一种转移抑制基因,在抑制肿瘤细胞的活力、侵袭和转移中发挥着重要的调节作用。母-胎界面中滋养细胞具有侵袭母体蜕膜组织的能力,但相对于恶性肿瘤的侵袭来说,滋养细胞的侵袭能力受到严格限制。本文拟研究转移抑制基因KAI1/CD82在母-胎界面的作用机制,从而有助于胚泡植入及滋养细胞侵袭调控的理解。第一部分转移抑制基因KAI1/CD82在人早孕期母胎界面的表达目的以早孕期正常妊娠为对照,探讨肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82在反复自然流产绒毛和蜕膜组织中的表达,为研究和治疗反复自然流产等妊娠疾患提供新线索。方法以胚胎植入与肿瘤转移侵袭相似为切入点,分别采用RT-PCR和Real-time PCR、免疫组化和Western-blot技术分析KAI1/CD82在人早孕期正常妊娠和反复自然流产的绒毛和蜕膜组织中的转录及翻译水平。结果反复自然流产母-胎界面KAI1/CD82转录水平明显高于正常妊娠(P<0.05)。反复自然流产的蜕膜组织KAI1/CD82蛋白表达明显高于正常妊娠(P<0.05);而在绒毛组织中不表达KAI1/CD82蛋白。结论蜕膜组织转移抑制基因KAI1/CD82高表达可能抑制滋养细胞侵袭,从而导致自然流产的发生。第二部分人蜕膜基质细胞通过表达KAI1/CD82降调节滋养细胞细胞侵袭性目的为了进一步探讨KAI1/CD82在母-胎界面的生物学作用,通过蜕膜基质细胞(DSC)与滋养细胞(VCT)共培养模型探讨KAI1/CD82在人母-胎界面的调节作用。方法模拟DSC和VCT体内接触微环境,建立了人子宫内膜基质细胞(ESC)和滋养细胞BEWO细胞株共培养体系,对ESC细胞进行RNA干扰,探讨ESC可能通过表达KAI1/CD82对滋养细胞侵袭性的调节作用。结果ESC与滋养细胞共培养促进了滋养细胞的侵袭能力。采用RNA干扰技术成功地使ESC细胞KAI1/CD82基因沉默。沉默了KAI1/CD82基因的ESC细胞可导致BEWO细胞侵袭力进一步增强。结论蜕膜基质细胞表达的KAI1/CD82可抑制滋养细胞的侵袭,KAI1/CD82在精密调控滋养细胞的过度侵袭中发挥重要调节作用。第叁部分KAI1/CD82不参与环孢素升调节滋养细胞的侵袭能力目的拟探讨KAI1/CD82是否参与环孢素(CsA)促进滋养细胞的侵袭能力。方法分离纯化蜕膜基质细胞,并采用流式细胞术和In-cell Western方法分析CsA处理后蜕膜基质细胞CD82的表达。结果经CsA不同浓度和不同时间处理,蜕膜基质细胞KAI1/CD82表达无明显变化。结论蜕膜基质细胞表达的KAI1/CD82不参与CsA对滋养细胞侵袭功能的调节;CsA对滋养细胞促侵袭作用独立于KAI1/CD82。
韩丽英[8]2004年在《原因不明反复流产免疫相关因素的研究》文中研究说明反复流产是妇产科常见病，约有40%--60%病因不明，目前认为免疫因素尤为重要。近年来的研究表明，母体免疫系统尤其是子宫局部的免疫细胞能否识别并耐受胚胎抗原，直接影响妊娠的建立与维持，母体免疫系统对胚胎的免疫识别受免疫细胞和细胞因子的调节，大量研究表明，正常妊娠过程中母体对胚胎的免疫反应主要以Th2介导的体液免疫为主，Th1介导的细胞免疫往往导致妊娠失败。 协同刺激分子及其受体介导的信号途径在T细胞的激活和行使效应功能中发挥重要作用，正在成为对临床疾病进行免疫干预最有希望的手段之一。CD86与CD28的结合可促进IL-4的产生，使T细胞倾向于发生Th2类炎性反应。研究认为CD28可抑制由CTLA4可引起Th1反应，诱导Th2因子的产生。抗原递呈细胞表面共刺激分子CD80/CD86的表达异常在自然流产的发病中可能起重要作用。T细胞发育过程中的克隆清除的主要方式是T细胞的凋亡，而细胞凋亡主要由Fas/FasL介导。Fas与FasL之间的相互作用在克隆清除、免疫耐受、免疫赦免以及免疫应答过程中均具有重要作用。妊娠期绒毛间隙及胎盘床中表达Fas的母体白细胞被激活，胎儿滋养细胞大量表达FasL，通过Fas/FasL信号诱导活化母体白细胞的凋亡，使胎儿逃避母体的溶细胞毒性，从而保证妊娠的顺利进行。Th1和Th2型细胞对Fas、FasL诱导的细胞凋亡的敏感性不同，表现为Th1型细胞的凋亡迅速，Th2型
邢长英[9]2006年在《补肾益气方调控人早孕滋养细胞SOCS3表达改善其生物学功能的研究》文中研究表明反复自然流产是最常见的妊娠并发症，严重危害妇女的生殖健康，母胎界面免疫内分泌调节异常是其重要原因。我们系列临床研究和动物实验表明，补肾益气方促进滋养细胞增殖及其分化，提高孕鼠蜕膜IL-10／IFN-γ比值及血中孕酮、PRL水平，整体调节生殖免疫内分泌网络平衡，但是具体调控机制不明。细胞因子信号转导抑制子(suppressors of cytokine signaling，SOCS)蛋白是近年发现的细胞因子的负调控因子，调控众多细胞因子和激素的信号转导，参与调控免疫应答及内分泌功能。此外SOCS3调控细胞增殖信号通路的作用也开始被认识，动物实验表明SOCS3是调控滋养细胞发育、分化的重要因素：胎龄9.5天小鼠滋养细胞表达SOCS3，若SOCS3缺失则小鼠滋养细胞受损，孕13天内胎鼠全部死亡，但是人早孕母胎界面的SOCS表达尚无报道。在了解人正常早孕母胎界面SOCS表达基础上，研究补肾益气方调控人早孕滋养细胞SOCS3表达及对细胞生长、分泌、细胞问相互对话等生物学功能的作用，为进一步探索母胎界面免疫内分泌网络调节机制及中药新的药效机理奠定基础。本研究主要包括叁部分实验内容：第一部分人正常早孕母胎界面SOCS1、SOCS2、SOCS3表达及其调控目的了解人正常早孕绒毛组织、蜕膜组织SOCS1、SOCS2、SOCS3表达特征，研究体外培养细胞滋养细胞和蜕膜基质细胞SOCS1、SOCS2、SOCS3基础表达，初步探讨调控人早孕母胎界面SOCS表达的可能因素。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot法检测SOCS1、SOCS2、SOCS3基因及蛋白表达；冰冻切片免疫组化定位检测母胎界面SOCS蛋白；胰蛋白酶／DNaseⅠ分步消化，硅化聚乙酰胺吡咯烷酮(Percoll)密度梯度离心法，分离纯化人正常早孕细胞滋养细胞、蜕膜基质细胞，经抗Cytokeratin7、Vimentin单克隆抗体免疫细胞化学鉴定其纯度；ELISA法检测细胞滋养细胞、蜕膜基质细胞IL-10、IFN-γ分泌。结果(1)RT-PCR结果显示：人正常早孕绒毛组织、蜕膜组织见SOCS1、SOCS2、SOCS3基因表达，其中SOCS3表达较为普遍，绒毛／蜕膜阳性率73.7％／71.1％；SOCS2次之，绒毛／蜕膜阳性率50.0％／39.5％；SOCS1表达最少，绒毛／蜕膜阳性率34.2％／31.6％，绒毛组织及蜕膜组织SOCS1、SOCS2、SOCS3基因多为中、低表达，SOCS蛋白表达特征与转录水平基本一致。SOCS1、SOCS2、SOCS3蛋白分布于绒毛滋养细胞全层，散在分布于蜕膜间质；滋养细胞和蜕膜细胞表达的SOCS蛋白既可以分布在细胞浆内，也可以分布在细胞核内，或者兼而有之。(2)体外分离人早孕细胞滋养细胞和蜕膜基质细胞，予1％胎牛血清的DMEM-F12培养14h，两种细胞均表达SOCS2、SOCS3基因；同时细胞滋养细胞、蜕膜基质细胞分泌的IL-10，高于同种细胞培养2h时的分泌水平(P＜0.05)，IFN-γ分泌无明显变化(P＞0.05)。(3)IL-10(0.1ng／ml)可上调细胞滋养细胞、蜕膜基质细胞SOCS2、SOCS3基因表达。结论正常母胎界面表达SOCS1、SOCS2、SOCS3，细胞滋养细胞和蜕膜基质细胞自分泌和旁分泌IL-10可能是母胎界面表达SOCS2、SOCS3的诱因之一，SOCS可能参与母胎界面免疫内分泌网络的调节，进一步研究SOCS的生物学功能将为了解复杂的妊娠机制提供有价值的信息。第二部分补肾益气方促进人细胞滋养细胞SOCS3表达及其生长目的检测补肾益气方对原代培养人早孕细胞滋养细胞及人滋养细胞肿瘤JAR细胞株SOCS3表达的调控，探讨中药促进细胞滋养细胞生长的作用机制。方法采用Percoll密度梯度离心法，分离纯化人正常早孕细胞滋养细胞，免疫细胞化学鉴定其纯度；RT-PCR法检测细胞滋养细胞SOCS3基因表达；Western blot检测细胞滋养细胞SOCS3蛋白表达、STAT3活化及ERK磷酸化的变化；MTT法检测人细胞滋养细胞、JAR细胞株增殖活力；PCNA-PE单标志流式细胞术分析细胞增殖情况、Annexin V-FITC／PI双标记流式细胞术分析细胞早期凋亡；用SOCS3特异性的siRNA转染JAR细胞，realtime PCR等法验证转染效果，检测转染后细胞ERK1／2的活化及STAT3的磷酸化；用SOCS3正义基因转染JAR细胞，促进SOCS3表达，PCNA-PE单标志流式细胞术分析细胞增殖变化。结果(1)10％和20％补肾益气方含药血清呈浓度依赖性增强人正常早孕细胞滋养细胞增殖活力及PCNA表达：中药对JAR细胞株有类似作用。1％胎牛血清培养细胞滋养细胞48h，Annexin V-FITC~+PI~-细胞为38.19±7.45％，加入10％和20％中药处理后，滋养细胞凋亡显着减少，分别为14.61±0.66％、5.79±1.74％，其抑制作用呈剂量依赖关系，其中20％含药血清作用最强。(2)10％和20％补肾益气方含药血清上调人细胞滋养细胞SOCS3表达的作用相似：中药处理1h，细胞SOCS3表达己增加，2h达到峰值，随后下降，中药作用4h细胞SOCS3表达接近或达到基础水平；20％含药血清上调的SOCS3表达强度高于10％含药血清组。(3)补肾益气方含药血清以浓度依赖性方式促进人细胞滋养细胞ERK1／2磷酸化，但是未见中药诱导的STAT3活化；10％含药血清作用10min即可促进JAR细胞ERK1／2磷酸化和SOCS3表达，该效应至少维持8h。(4)MEK激酶抑制剂U0126抑制中药诱导的人细胞滋养细胞ERK1／2磷酸化及SOCS3表达同时，抑制中药诱导的细胞滋养细胞增殖活力及PCNA表达，一定程度上抑制中药的抗滋养细胞早期凋亡作用。(5)mTOR抑制剂雷帕霉素也可抑制中药诱导的人细胞滋养细胞SOCS3表达，抑制细胞增殖活力及PCNA表达，但是不影响中药诱导的ERK磷酸化。(6)SOCS3 Stealth~(TM)siRNA转染JAR细胞48h后，予10％补肾益气方含药血清作用1h、2h、4h、8h，可见JAR细胞ERK1／2磷酸化，未见SOCS3蛋白的表达及STAT3磷酸化。(7)SOCS3正义基因转染JAR细胞使SOCS3过表达，无血清培养48h转染组细胞PCNA阳性率高于未转染组。结论补肾益气方含药血清呈浓度依赖性促进人细胞滋养细胞增殖，抑制细胞早期凋亡；补肾益气方作用4h内，可迅速上调细胞滋养细胞SOCS3表达，随后降调SOCS3表达；中药可能通过MAPK／ERK1／2、PI3K／m TOR而不是STAT3介导的信号通路诱导细胞滋养细胞SOCS3表达及细胞增殖；SOCS3表达变化并不影响ERK磷酸化；SOCS3可能参与了中药的促人细胞滋养细胞生长作用。第叁部分补肾益气方促进人滋养细胞和蜕膜基质细胞分泌功能的研究目的了解补肾益气方作用后，人早孕滋养细胞增殖活力与细胞分泌功能之间的关系，分析影响人滋养细胞与蜕膜基质细胞之间相互作用及滋养细胞表达SOCS3的可能因素。方法采用Percoll密度梯度离心法，分离纯化人早孕滋养细胞、蜕膜基质细胞，免疫细胞化学鉴定其纯度；MTT法检测细胞增殖活力，ELISA法检测细胞培养上清中IL-10、IFN-γ，化学发光法检测孕酮、PRL；hIL-10-FITC单标志流式细胞术分析细胞IL-10R表达；Western blot检测SOCS3蛋白表达。结果(1)补肾益气方含药血清作用24h、36h、48h，呈时间-浓度依赖方式增强人早孕滋养细胞增殖活力，同时促进细胞孕酮、IL-10的分泌，上调细胞IL-10R的表达，中药对细胞分泌的IFN-γ无影响；中药促进人滋养细胞增殖活力作用与细胞分泌的孕酮、IL-10／IFN-γ比值之间呈直线正相关关系。(2)补肾益气方含药血清作用蜕膜基质细胞24h、36h、48h，以时间和／或浓度依赖方式促进蜕膜基质细胞PRL、IL-10的分泌，上调细胞IL-10R的表达。(3)IL-10(0.1ng／ml及1ng／ml)作用2h-8h可促进人早孕滋养细胞SOCS3蛋白表达。结论补肾益气方含药血清通过促进人早孕滋养细胞、蜕膜基质细胞激素及IL-10分泌、上调IL-10R表达，加强两种细胞之间的联系；细胞分泌功能的改善上调滋养细胞SOCS3表达，滋养细胞增殖活力又与细胞分泌功能之间相互促进；中药可能通过调控人早孕滋养细胞SOCS3表达改善其生长、分泌等生物学功能。综上所述，本研究系统研究人正常早孕母胎界面SOCS1、SOCS2、SOCS3表达特征，提出母胎界面自分泌和旁分泌的IL-10是SOCS表达的调控因素之一；研究提示补肾益气方通过MAPK／ERK1／2、PI3K／mTOR信号通路调控SOCS3表达、促进人细胞滋养细胞生长，并初步探讨SOCS3在人细胞滋养细胞增殖中的作用；以SOCS3为线索研究人早孕滋养细胞增殖活力和分泌功能的相互促进作用，解析人滋养细胞SOCS3表达与其生物学功能相辅相成的关系。进一步探讨人早孕滋养细胞SOCS3生物学功能将有助于阐明胎盘生长发育、母胎界面免疫内分泌网络平衡的机制。
周英[10]2006年在《肾虚自然流产蜕膜Th1/Th2表达及助孕3号方对流产大鼠TCRγδT和细胞因子调控的研究》文中研究表明自然流产是妇科常见病之一,不仅损害妇女的身心健康,甚至还可能会引发一系列家庭问题,而给社会带来不稳定因素。所以寻找一种防止流产的有效方法具有积极的临床意义和社会意义。 1.文献研究 目前大多数学者将Th1/Th2型细胞因子介导的免疫反应描述为Th1型免疫反应和Th2型免疫反应。细胞因子在病理妊娠丢失中有着重要作用。Th1细胞因子对妊娠有害,而Th2细胞因子却对维持妊娠起着积极作用。两者之间的平衡对维持正常妊娠起着重要的作用。平衡被打破,将导致疾病如自然流产的发生。 妊娠早期蜕膜中含大量淋巴细胞,γδT细胞数量较非妊娠期增加1倍。γδT细胞可根据不同的病原体刺激产生不同的细胞因子,进而影响Th1和Th2细胞的分化成熟,从而参与免疫调节。γδT细胞的许多生物学特点仍处于被探索阶段,但人们已发现γδT细胞的特性既与Th相似即分泌多种细胞因子,又与CTL相似即对多种细胞表现出细胞毒活性。已有资料显示TCRγδT细胞具有识别绒毛滋养细胞表达的人类白细胞抗原,参与调节Th1/Th2型细胞因子的平衡偏移,对母胎免疫的调节起着重要作用。 2.临床研究:母胎界面Th1/Th2细胞因子平衡与肾虚自然流产相关性的研究 所有病例均来源于2005年3月至2005年12月在广州中医药大学第一附属医院妇科门诊和住院部就诊的妇科病人。所有受试病例必须按照诊断标准、纳入标准和排除标准进行筛选。选择肾虚型早期自然流产的孕妇10例为实验组,正常早期妊娠的孕妇要求人工流产者10例为对照组。采用半定量RT-PCR检测蜕膜组织Th1型(IL-2、IFN-γ)/Th2型(IL-4、IL-10)细胞因子mRNA表达。 本研究再次证实妊娠期Th1/Th2细胞因子的平衡偏移与SA发生具有相关性,结果提示肾虚型自然流产患者母胎界面细胞因子Th1(IL-2、IFN-γ)/Th2(IL-10、IL-4)平衡失调可能是自然流产肾虚证的本质之一。本研究进一步为“肾主生殖”理论提供了科学依据,同时亦为健脾补肾法治疗该病提供了科学根据。
参考文献：
[1]. 妊娠早期不明原因自然流产患者绒毛及蜕膜组织血管增殖及细胞凋亡的研究[D]. 董枫. 河北联合大学. 2011
[2]. 不明原因早期自然流产体外反应体系中蜕膜淋巴细胞增殖和绒毛滋养细胞凋亡[D]. 侯震晖. 四川大学. 2004
[3]. 复发性流产的病因分析及其与趋化因子CXCL12、CCL2、RANTES表达异常的研究[D]. 张钰. 天津医科大学. 2010
[4]. 绒毛蜕膜组织中白血病抑制因子表达水平与稽留流产的相关性研究[D]. 刘俐伶. 广西医科大学. 2009
[5]. CD82在人早孕期母—胎界面的调节作用[D]. 李明清. 复旦大学. 2010
[6]. EPO在人早孕期母—胎界面的功能调节[D]. 季玉琴. 南通大学. 2010
[7]. KAI1/CD82在人早孕期母—胎界面的表达及其对滋养细胞侵袭性的调节作用[D]. 邵珺. 苏州大学. 2008
[8]. 原因不明反复流产免疫相关因素的研究[D]. 韩丽英. 吉林大学. 2004
[9]. 补肾益气方调控人早孕滋养细胞SOCS3表达改善其生物学功能的研究[D]. 邢长英. 复旦大学. 2006
[10]. 肾虚自然流产蜕膜Th1/Th2表达及助孕3号方对流产大鼠TCRγδT和细胞因子调控的研究[D]. 周英. 广州中医药大学. 2006
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