涂洪谊[1]2004年在《DNA甲基化酶抑制剂与组蛋白脱乙酰化酶抑制剂的抗肿瘤研究》文中指出目的：DNA甲基化和组蛋白乙酰化是表遗传学调控基因表达的重要机制，二者在肿瘤发生、发展和转归的过程具有重要作用．DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza-C)通过对DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的抑制逆转甲基化介导的表遗传学异常，起到对肿瘤细胞生长抑制和诱导分化作用．组蛋白脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(sodium phenylbutyrate,SPB)通过对组蛋白去乙酰化酶(histone seacetylase,HDAC)的抑制而达到对肿瘤细胞的生长抑制、诱导分化及诱导凋亡的作用。本试验的目的是：(1)比较单独和联合用药应用5-aza-C和SPB的体外生长抑制及致凋亡作用；(2)评价5-aza-C和SPB的抗肿瘤增效作用；(3)比较单独及联合应用5-aza-C和SPB对DNMT1、DNMT3a和HDAC表达的影响；(4)应用基因芯片的方法评价5-aza-C和SPB单独和联合应用时重新激活被沉默的基因的能力。 方法：(1)在体外培养人大肠癌细胞LoVo，用光镜、电镜、流式细胞术及DNA片段化分析观察单独或联合应用5-aza-C和SPB对LoVo细胞的生长抑制及诱导凋亡作用；(2)将5-aza-C和SPB二者联用或和胸苷合成酶(Thymidylate synthase,TS)抑制剂洛拉曲克联用观察5-aza-C和SPB的抗肿瘤增效作用；(3)提取空白及处理组的总RNA，用RT-PCR的方法比较单独及联合应用5-aza-C和SPB对DNMT1、DNMT3a和HDAC叁者mRNA表达的影响；(4)提取空白及处理组的总RNA，经质量检测，用联合基因公司人类基因组分类Ⅰ芯片(BioStarH-I)检测被5-aza-C和SPB单独和联合应用重新激活的基因。 结果：(1)光镜观察到5-aza-C和SPB单用及联用均具有生长抑制、诱导DNA甲基化酶抑制剂和组蛋白脱乙酞化酶抑制剂的抗肿瘤研究分化及凋亡作用;电镜和DNA片段化分析在5一aza一C组及联用组发现核改变及DNA的片段化，但SPB组没有观察到;流式细胞术观察到5一aza一C和SPB单用及联用均具有生长抑制及诱导凋亡作用.(2)5一aza-C和SPB联用在Lovo及人肝癌细胞HeP3B均取得了明显的增效作用;5一aza一C或sPB与洛拉曲克联用时在Lovo细胞的效果好于HeP3B细胞，且大多取得了良好的增效作用.(3) RT一PcR结果与空白组相比，5一aza一c组使DNMTI、DNMT3a和HDAC叁者1五RNA分别减少了59.3%、38.6%和7.4o/o;sPB组使叁者分别减少了7.6%、4.6%和60.3%;联合组效果明显，叁者分别减少了78.9%、75.0%和84.4%.(4)经过Bios柱叮H一I芯片检测，5一aza一C组下调了4个基因的表达，同时上调了14个基因;SPB组下调了2个基因的表达，同时上调了14个基因;联合组下调了12个基因的表达，同时上调了46个基因的表达.结论:(1)甲基化抑制剂5一aza一C和脱乙酞化抑制剂SPB均有良好的肿 瘤细胞生长抑制及凋亡诱导作用. (2)5一aza一C和SPB均显示了良好的抗肿瘤增效作用，提示针对 DNMT和HDAC的抑制剂可能在临床与其他化疗药物的联合 应用及克服MDR有很好的前景. (3)肿瘤细胞通过异常的甲基化和脱乙酞化确实抑制了和肿瘤细 胞负性生长相关的众多基因，5一aza一C和SPB可以通过对 DNMT和HDAC的调节逆转肿瘤细胞的表遗传紊乱. (4)联合应用甲基化抑制剂和脱乙酞化酶抑制剂对于逆转肿瘤的 表遗传学紊乱可以明显增强二者单用的效果，提示甲基化和 脱乙酞化在肿瘤中的作用可能是偶联的. 上述试验表明，甲基化抑制剂和脱乙酞化酶抑制剂可以通过对中文摘要DNMT和HDAC的抑制，重新打开这些由于异常表遗传学而沉默的基因，逆转由于肿瘤组织表遗传学紊乱而介导的生物学效应，表遗传学的基因“开关”作用可能在肿瘤的发生、发展及预后中具有重要地位.
刘涓[2]2012年在《DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷的抗胃癌作用研究》文中研究表明1.背景和目的目前文献表明,肿瘤基因的功能异常在肿瘤发生及发展的一系列病理过程中扮演着不可或缺的角色。除了机体内部基因突变及外来刺激物激活癌基因之外,启动子区域CpG岛的甲基化异常导致的抑癌基因的沉默亦是肿瘤发生的重要机制。研究证实,DNA甲基转移酶催化的DNA甲基化作用类似于基因编码区的突变,正是这一修饰作用导致了抑癌基因的沉默。与基因突变有异的是,DNA的异常甲基化状态可被DNA甲基转移酶抑制剂所逆转,从而使沉默的抑癌基因重新表达。目前被FDA认证的DNA甲基转移酶抑制剂中,以5-氮杂胞苷(5'-azacytidine)和5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)的应用最为广泛。其中,5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)因其只与DNA相结合,对RNA及蛋白质合成的影响较5-氮杂胞苷(5'-azacytidine)小,同时它的脱甲基化作用至少是5-氮杂胞苷(5’-azacytidine)的十倍,因此已成为目前普遍使用的DNA甲基转移酶抑制剂。胃癌,一种高死亡率的肿瘤,日益威胁着全球人类的健康。国内外研究学者均已证实,启动子区域的高度甲基化所诱导的一系列抑癌基因的沉默是胃癌发生的重要分子学事件。如何在目前化疗药物疗效欠佳的前提下,研发一种卓有成效的抗胃癌制剂是国际肿瘤学研究领域关注的热点。5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine),一种核苷类似物,因其具有显着的脱甲基化、诱导肿瘤细胞凋亡等作用,因而在临床上被广泛应用于骨髓增生异常综合征(MDS)的治疗。在实体肿瘤中包括胃癌,5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)是否具有类似的抗癌毒性,及其具体的分子作用机制是本课题研究的关键所在。一方面,本实验旨在观察甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)是否对胃癌细胞具有生长抑制作用；另一方面,通过深入探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)与各种信号通路之间以及与基因甲基化之间的关系,为明确胃癌的致病机制及未来基因治疗方向提供一定的理论和现实依据。2.方法本实验选取野生型P53的胃癌AGS细胞分别用不同浓度和不同时间的5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理,MTT检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期的变化。为了进一步明确5-氮杂-2’-脱氧胞苷的处理能否诱导肿瘤细胞凋亡,本实验用一系列的检测手段,例如：Annexin Ⅴ, DNA ladder、Hoechst33258染色以及caspases活性测定。既往研究已证实,5-氮杂-2’-脱氧胞苷可掺入细胞的DNA从而诱导细胞发生DNA断裂损伤。为了验证这一理论在胃癌细胞中的真实性,本实验采用了彗星实验。Western blotting(?)(?)RT-PCR用来分析细胞在5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理前后有关基因和蛋白的变化。此外,也用甲基特异性PCR (Methylation Specific PCR; MSP)去进一步检验5-氮杂-2’-脱氧胞苷对肿瘤AGS细胞甲基化状态的影响。3.结果与讨论从第一部分的实验结果可知,5-氮杂-2’-脱氧胞苷显着地抑制了胃癌AGS细胞的生长增殖。更为重要的是,其细胞毒性作用表现为浓度和时间依赖关系。流式分析细胞周期的结果显示,胃癌的AGS细胞在用不同时间的5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理后,细胞阻滞在G2期。在有关凋亡的检测中,本次实验发现5-氮杂-2’-脱氧胞苷显着地诱导了胃癌AGS细胞发生凋亡。第二部分的实验就5-氮杂-2’-脱氧胞苷的抗胃癌作用机制进行了深入的探讨,得出了如下的结果：1)5-氮杂-2’-脱氧胞苷诱导的胃癌AGS细胞发生凋亡是由caspase9所介导的线粒体凋亡路径而发挥作用的。同时,在5-氮杂-2’-脱氧胞苷作用过程中,由于线粒体损伤导致了凋亡因子如：BAX和细胞色素C的释放。2)彗星实验的结果显示,5-氮杂-2’-脱氧胞苷使AGS细胞发生DNA断裂损伤,并且它表现出时间依赖效应。ATM(ataxia-telangiectasia mutated), DNA损伤的感应因子,在5-氮杂-2’-脱氧胞苷作用后即发生磷酸化,从而激活了相应的下游通路的效应因子如：P53、P21以及caspases活化。3)P53的状态可影响胃癌细胞对5-氮杂-2’-脱氧胞苷的敏感性,因为实验表明用P53的抑制剂可显着减弱5-氮杂-2’-脱氧胞苷对AGS的细胞毒性作用。4)5-氮杂-2’-脱氧胞苷通过抑制DNA甲基转移酶的活性而使沉默的甲基化抑癌基因P16重新恢复表达,使它在5-氮杂-2'-脱氧胞苷的抗肿瘤机制中发挥了一定的作用。4.结论5-氮杂-2’-脱氧胞苷通过促进肿瘤细胞发生凋亡,从而使其可作为一种有效的抗胃癌药。这一结论将为5-氮杂-2’-脱氧胞苷在临床上的应用提供强有力的依据。
参考文献：
[1]. DNA甲基化酶抑制剂与组蛋白脱乙酰化酶抑制剂的抗肿瘤研究[D]. 涂洪谊. 第一军医大学. 2004
[2]. DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷的抗胃癌作用研究[D]. 刘涓. 武汉大学. 2012
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