论文摘要
尼古丁是一种天然的生物碱,进入人体后能对多种组织如心、脑、肺和血管等造成损伤,容易引发肺癌在内的多种疾病。我国是烟草生产和消费的大国,烟草加工过程中所产生的废弃物中含有较高浓度的尼古丁,给环境和人体健康带来极大威胁。微生物处理该类型的污染是一种高效、可靠和无二次污染的绿色处理方式,且生物降解的方法反应条件温和,操作简单,成本低廉,是充分降解尼古丁的有效手段。同时,微生物酶法降解尼古丁的中间产物2,5-二羟基吡啶是重要的医药合成前提物质,应用潜力极大。因此,分离纯化高效降解尼古丁的关键酶,研究其降解机制,充分发挥其降解能力,具有很大的探索前景。本文以Pseudomonas sp.ZZ-5为实验菌株,通过（NH 4）2SO4沉淀、DEAE sepharose、Pheny1 sepharose和Superdex-200凝胶过滤等蛋白纯化步骤,获得纯化后的6-羟基-3-琥珀酰吡啶羟化酶（6-hydroxy-3-succinylpyridine hydroxylase）HSPHZZ,经过SDS-PAGE检验显示单一条带,分子量约为44.3 KDa;该蛋白被纯化17.6倍,得到13.4%的产率和5.1 U/mg的比活性。通过蛋白N末端测序,获得HSPHZZ的N-末端氨基酸序列为M-S-G-H-L-R-V-I-I-V-G-G-G-P;设计引物,采用分子克隆方法获得HSPHZZ基因全长,基因大小为1206 bp,含有401个氨基酸,HSPHZZ氨基酸序列与来自恶臭假单胞菌属的HSPHs显示出高度相似性。将HSPHZZ基因克隆到原核表达载体pET22b,获得重组质粒pET22b–HSPHZZ基础上,对HSPHZZ进行表达与纯化,并对其酶学性质进行研究。重组HSPHZZ分子量为45 KDa;最适温度与pH为30℃和8.5;酶活性不受Mg2+,Ni2+,Ca2+,Mn2+,K+,Na+显著影响,Cu2+,Co2+,Zn2+和Fe2+显著抑制酶活性;甲醇、丙酮、甲醛、二甲基甲酰胺、氯仿、甲苯和1%（w/v）的Triton X-100显著抑制酶活性;在最佳条件下,该酶在40 min内产生2,5-DHP（85.3 mg/L）,转化率为74.9%（w/w）。为了提高催化性能并降低生物催化过程的成本,通过Immobead 150固定化HSPHZZ(ImmHSPHZZ)并研究其催化性能。ImmHSPHZZ的最适pH为9.0,最适温度为35℃,酶和底物的最佳浓度分别为30 mg/L和0.75 mM。在最佳条件下,30 min后产生94.5 mg/L的2,5-DHP,转化率为85.4%;在8个反应循环和6天的储存后,分别保留了51.3%和75.0%的初始酶活性。与游离的HSPHZZ相比,固定化的ImmHSPHZZ具有较宽的pH和温度耐受范围,更高的转化率和储存稳定性。对尼古丁氧化酶（Nicotine oxidase）NOX就行了初步分析,在大肠杆菌中克隆表达获得纯化的重组NOX,分子量为55 KDa,以烟碱为底物,利用LC-MS分析检测酶活性反应产物,该酶降解烟碱生成假氧化尼古丁,初步判定该酶为尼古丁氧化酶。
论文目录
摘要abstract第一章 绪论 1.1 尼古丁的理化性质 1.2 尼古丁的污染现状 1.2.1 烟草生产及其废弃物污染 1.2.2 其他形式的尼古丁污染 1.3 微生物降解尼古丁的研究进展 1.3.1 降解尼古丁的微生物种类 1.3.2 尼古丁的微生物降解途径 1.3.3 微生物降解尼古丁中的酶学研究进展 1.3.4 微生物降解尼古丁的应用 1.4 固定化酶研究进展 1.4.1 固定化方法 1.4.2 固定化技术的应用 1.5 尼古丁降解产物的分析检测方法 1.5.1 HPLC技术 1.5.2 LC-MS技术 1.5.3 GC-MS技术 1.6 本课题的立题意义及研究内容 1.6.1 立题依据及意义 1.6.2 研究内容第二章 6-羟基-3-琥珀酰吡啶羟化酶的分离鉴定 2.1 实验材料与仪器 2.1.1 菌株 2.1.2 主要试剂 2.1.3 培养基 2.1.4 主要仪器 2.2 实验方法ZZ纯化'> 2.2.1 HSPHZZ纯化 2.2.2 SDS-PAGE电泳检测 2.2.3 蛋白含量测定 2.2.4 酶活性测定ZZ的 N-末端氨基酸序列'> 2.2.5 HSPHZZ的 N-末端氨基酸序列 2.2.6 基因克隆与表达质粒的构建 2.3 结果与讨论ZZ的纯化与鉴定'> 2.3.1 HSPHZZ的纯化与鉴定 2.3.2 LC-MS分析结果 2.3.3 GC-MS检测结果 2.3.4 酶解过程ZZ及其同源物的多序列比对结果'> 2.3.5 HSPHZZ及其同源物的多序列比对结果 2.4 本章小结ZZ表达纯化和酶学性质研究'>第三章 重组HSPHZZ表达纯化和酶学性质研究 3.1 材料与仪器 3.1.1 菌株与质粒 3.1.2 主要试剂 3.1.3 培养基 3.1.4 主要仪器 3.2 实验方法 3.2.1 重组质粒在大肠杆菌中的表达ZZ浓度测定'> 3.2.2 重组HSPHZZ浓度测定ZZ酶活性检测'> 3.2.3 重组HSPHZZ酶活性检测 3.2.4 酶学性质评价 3.3 结果与讨论ZZ纯化结果'> 3.3.1 重组HSPHZZ纯化结果 3.3.2 温度和pH对酶活性的影响 3.3.3 酶的热稳定性和pH稳定性 3.3.4 酶和底物浓度对2,5-DHP产生的影响 3.3.5 金属离子、有机溶剂和洗涤剂对酶活性的影响ZZ在最佳条件下从HSP生产2,5-DHP'> 3.3.6 重组HSPHZZ在最佳条件下从HSP生产2,5-DHP 3.4 本章小结ZZ合成2,5-DHP'>第四章 固定化HSPHZZ合成2,5-DHP 4.1 材料与方法 4.1.1 实验试剂 4.1.2 主要仪器ZZ在 Immobead 150 上的多点固定化'> 4.1.3 重组HSPHZZ在 Immobead 150 上的多点固定化ZZ的 SEM测定'> 4.1.4 ImmHSPHZZ的 SEM测定 4.1.5 酶学性质研究 4.2 结果与讨论ZZ酶在Immobead 150 上的固定化'> 4.2.1 纯化重组HSPHZZ酶在Immobead 150 上的固定化ZZ和 ImmHSPHZZ的扫描电子显微镜（SEM）分析'> 4.2.2 重组HSPHZZ和 ImmHSPHZZ的扫描电子显微镜（SEM）分析ZZ和 ImmHSPHZZ活性的影响'> 4.2.3 pH对重组HSPHZZ和 ImmHSPHZZ活性的影响ZZ和 ImmHSPHZZ活性的影响'> 4.2.4 温度对重组HSPHZZ和 ImmHSPHZZ活性的影响ZZ活性的影响'> 4.2.5 酶浓度对ImmHSPHZZ活性的影响ZZ活性的影响'> 4.2.6 HSP浓度对ImmHSPHZZ活性的影响ZZ在最佳条件下从HSP生产2,5-DHP'> 4.2.7 ImmHSPHZZ在最佳条件下从HSP生产2,5-DHP 4.2.8 存储稳定性和可重用性 4.3 本章小结第五章 重组尼古丁氧化酶的表达与纯化 5.1 实验材料 5.1.1 菌株与质粒 5.1.2 主要试剂 5.1.3 培养基 5.1.4 主要仪器 5.2 实验方法 5.2.1 NOX在大肠杆菌中的表达与分离纯化 5.2.2 NOX浓度及酶活性的测定 5.3 结果与讨论 5.3.1 NOX纯化结果 5.3.2 LC-MS分析结果 5.3.3 酶解过程 5.4 本章小结第六章 结论与展望 6.1 结论 6.2 展望参考文献附录 1 攻读硕士学位期间发表论文目录致谢
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 郑亚东
导师: 魏涛,董彩文
关键词: 烟草,尼古丁,酶特性,二羟基吡啶,固定化
来源: 郑州轻工业大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用
单位: 郑州轻工业大学
分类号: X592;X172
总页数: 82
文件大小: 3720K
下载量: 72
相关论文文献
- [1].国外专利文献[J]. 精细化工原料及中间体 2008(03)
- [2].尼古丁污染及其微生物降解研究进展[J]. 化学与生物工程 2014(08)
- [3].根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解代谢中agnE基因的克隆与功能鉴定[J]. 微生物学报 2018(05)
- [4].影响5-FU疗效的研究进展[J]. 中国肿瘤临床 2010(21)
- [5].含氮过渡金属有机配合物的合成、表征及催化应用探讨[J]. 云南化工 2018(11)
- [6].2-芳基-4-吗啉-6-三氮唑基嘧啶环类衍生物的合成及抗肿瘤PI3K抑制剂的活性[J]. 精细化工 2014(09)
标签：烟草论文; 尼古丁论文; 酶特性论文; 二羟基吡啶论文; 固定化论文;
