脑内炎症微环境在骨髓间充质干细胞定向迁移过程中的作用研究

论文摘要

研究背景:骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一种起源于胚胎中胚层,发现于骨髓中的具有自我复制和多向分化潜能的非造血多能干细胞。由于其可以定向迁移至机体损伤部位,通过分化和旁分泌的方式,调节损伤区域组织和功能的恢复使其成为细胞移植治疗的理想细胞。在中枢神经系统中,多种脑内脑外疾病都可以引起脑组织损伤,造成神经功能缺失,而中枢神经系统损伤在细胞水平主要表现为神经细胞的凋亡和小胶质细胞的激活,而激活的小胶质细胞又能进一步加重神经细胞的凋亡,因此调节小胶质的激活成为目前神经系统疾病研究的热点。以往的研究发现小胶质细胞的激活主要表现为局部炎症反应,以IL-6、TNF-α、IL-1β等炎症因子分泌增多,形成炎症微环境为特点。有研究表明移植的BMSCs可以通过迁移定位于神经损伤部位调节小胶质细胞的激活以及促进神经功能的恢复,但是,炎症微环境是否参与BMSCs的迁移,以及其中具体哪种成分参与了 BMSCs的迁移及其具体的机制迄今尚不明确,这些问题如若得不到解决,将直接导致移植的BMSCs最终只有少部分细胞到达目的区域,降低移植效率。因此,阐明影响BMSCs定向迁移的炎症微环境因素及其调控机制对于提高移植效率、加速其应用于临床十分重要。在本研究中,我们通过脂多糖（LPS）建立体内体外神经系统炎症模型,检测神经系统炎症微环境中炎症因子水平的变化,同时收集富含炎症因子的上清以模拟受损中枢神经系统（CNS）在体内的炎症微环境来探究其对BMSCs迁移的影响及其具体的调节机制,利用在体实验进一步对实验结果进行验证,本研究的意义旨在提高BMSCs的移植效率,为BMSCs的临床应用提供更多的实验依据。研究方法:1.明确BV2条件培养基（CM）对BMSCs迁移的影响,分析在炎症微环境中BV2分泌的细胞因子水平的变化。首先从一月龄雌性SD大鼠双侧股骨骨髓中获取原代BMSCs,使用第3-6代进行后续实验,同时我们在体外利用BV2细胞系替代小胶质细胞进行实验。为了获得不同浓度的CM,分别用100ng/ml和1000ng/ml的LPS处理BV2细胞收集上清,通过Transwell实验评估不同浓度CM对BMSCs迁移的影响。接下来,我们分别运用酶联免疫吸附法（ELISA）和RT-PCR实验检测了不同浓度的CM和细胞中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和白介素-1β（IL-1β）表达水平的变化,以确定在炎症微环境中BV2细胞是否是通过改变炎症因子的分泌谱来影响BMSCs的迁移,同时选定具体的炎症因子以进行以下的深入探究。2.探索IL-6对BMSCs定向迁移的影响。通过Transwell实验利用IL-6特异性中和抗体和外源性IL-6细胞因子,来探究IL-6对BMSCs迁移的影响。3.探究IL-6在BMSCs定向迁移中的作用机制。（1）磷酸化的信号传导及转录激活因子（p-STAT3）、磷酸化的细胞外调节蛋白激酶（p-ERK1/2）、磷酸化的粘着斑激酶（p-FAK）在IL-6促进BMSCs定向迁移中的作用。首先通过Western blots检测了用不同浓度CM处理的BMSCs中p-STAT3、p-ERK1/2、p-FAK的表达情况;然后运用特异性STAT3抑制剂（AG490）、ERK1/2抑制剂（PD98059）、FAK抑制剂（PF573228）预处理BMSCs,通过Transwell实验检测BMSCs的迁移情况;最后通过添加IL-6特异性中和抗体和外源性IL-6细胞因子,进一步检测p-STAT3、p-ERK1/2、p-FAK表达水平的变化,以确定p-STAT3、p-ERK1/2、p-FAK是否参与IL-6促进BMSCs定向迁移这个过程。（2）在IL-6促进BMSCs定向迁移的过程中,p-STAT3、p-ERK1/2对p-FAK表达的影响。使用AG490或PD98059预处理BMSCs,利用Western blots技术检测其中p-FAK表达情况,以确定p-STAT3和p-ERK1/2是否是通过调节p-FAK的表达进而影响BMSCs的定向迁移。4.小鼠在体实验验证IL-6对BMSCs迁移的作用及其作用机制。（1）构建C57BL/6小鼠脑部炎症模型并分析其中炎症因子水平的变化。选取体重在20-30g、年龄相近的C57BL/6雄性小鼠,每组5只,通过侧脑室注射0.25mg/kg的LPS构建脑部炎症模型,通过Western blots实验检测造炎后脑内炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。（2）验证IL-6在BMSCs定向迁移中的作用及作用机制。选取20-30g同龄的C57BL/6雄性小鼠25只,分为LPS组、LPS+BMSCs组、LPS+BMSCs+IL-6抗体组、LPS+BMSCs+AG490组、LPS+BMSCs+PD98059组五组,每组各5只小鼠,通过尾静脉给予或不给予106个绿色荧光蛋白标记的BMSCs（GFP-BMSCs）、GFP-BMSCs尾静脉注射之前是否用抑制剂预处理、腹腔给予或不给予O.1mg/kg的特异性IL-6中和抗体构建各组在体模型,通过免疫组织化学染色（IHC）计数各组小鼠脑GFP-BMSCs数量,在体内环境中进一步验证IL-6对BMSCs定向迁移的作用及其作用机制。研究结果:1.通过Transwell实验发现CM确实促进了间充质干细胞的细胞迁移,并且与100-CM相比,1000-CM显著增强了间充质干细胞的迁移能力,并且表现出了浓度依赖性。ELISA分析显示LPS刺激显著增加了 CM中TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌,与100-CM相比,1000-CM中3种炎症因子丰度更高。通过RT-PCR检测BV2细胞内3种炎症因子的表达水平发现,1000ng/ml、100ng/ml LPS刺激BV2细胞能够显著促进细胞内3种炎症因子在mRNA水平的表达,但未呈现出浓度依赖性。2.通过Transwell实验发现,与对照组相比,将特异性抗IL-6抗体加入1000-CM中和IL-6后,BMSCs的迁移细胞数明显降低,相反,当外源性IL-6细胞因子单独加入DMEM培养基中时,BMSCs迁移细胞数明显增加。3.（1）通过Western blots检测发现,CM显著增加了BMSCs中p-STAT3、p-ERK1/2、p-FAK的表达,并且随着CM浓度的增加,BMSCs中p-STAT3、p-ERK1/2、p-FAK的表达逐渐升高。使用特异性通路抑制剂后,Transwell实验检测发现抑制剂显著抑制1000-CM诱导的BMSCs的迁移,而抑制剂本身对BMSCs的迁移没有明显的影响。用加入特异性外源性IL-6细胞因子或抗IL-6抗体的DMEM或1000-CM处理BMSCs,Western blots检测发现外源性IL-6细胞因子显著上调p-STAT3、p-ERK1/2、p-FAK的表达,特异性抗IL-6抗体显著下调p-STAT3、p-ERK1/2、p-FAK的表达。（2）在1000-CM中加入AG490或（和）PD98059处理BMSCs,通过Western blots检测发现,AG490或（和）PD98059都能够显著抑制p-FAK的表达。4.（1）通过Western blots实验检测发现,脑内造炎后,炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达显著上调。（2）通过IHC染色发现,与单纯炎症组相比,使用抗IL-6中和抗体后,脑内定向迁移细胞数明显减少;使用特异性通路抑制剂后,脑内定向迁移的BMSCs数目显著减少。研究结论:LPS激活的BV2细胞CM中IL-6水平升高,当BMSCs在该CM中孵育时,IL-6通过进一步触发ERK1/2、STAT3和下游FAK发生磷酸化,从而促进BMSCs迁移。我们的研究进一步深入探索了 BMSCs迁移的分子机制,对临床应用BMSCs进行治疗性移植具有重要的意义。

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