新竹番茄曲叶病毒AC2与AC4的功能研究

论文摘要

菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）是双生病毒科（Geminiviridae）最大的属,包含400多个病毒种。近几十年来,begomoviruses在全球各地暴发,给农业生产造成严重威胁。研究begomovirus的基因功能,有助于认识begomovirus侵染机理,进而为begomovirus相关病害的防控提供理论支撑。新竹番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Hsinchu virus,ToLCHsV）是一种广泛分布于我国台湾、海南、广东、福建、浙江和江苏等地的begomovirus。本研究对ToLCHsV的AC2和AC4进行了功能解析,主要实验和结果如下:（1）AC2和AC4在ToLCHsV侵染中的作用:通过定点突变构建了三个ToLCHsV突变体:ToLCHsV-ΔAC2（不能表达AC2）、ToLCHsV-ΔAC4（不能表达AC4）和ToLCHsV-ΔAC2-AC4（不能表达AC2和AC4）,并通过本氏烟接种实验研究了这三个突变体的侵染性。发现三个ToLCHsV突变体都能系统侵染本氏烟,并造成严重症状。但在症状产生的时间上,ToLCHsV-ΔAC2比野生型ToLCHsV慢1-2天,而ToLCHsV-ΔAC4和ToLCHsV-ΔAC2-AC4比野生型ToLCHsV慢2-3天。在病毒DNA积累的动态上,三个ToLCHsV突变体表现出一定差异:在第9天,它们在本氏烟中的积累水平从高到低依次为ToLCHsV-ΔAC4、ToLCHsV-ΔAC2-AC4和ToLCHsV-ΔAC2,在第18天依次为ToLCHsV-ΔAC2-AC4、ToLCHsV-ΔAC4和ToLCHsV-ΔAC2;在第27天,ToLCHsV-ΔAC2-AC4的积累水平最低,而ToLCHsV-ΔAC2和ToLCHsV-ΔAC4没有明显差别。然而,在所有三个时间点,三个ToLCHsV突变体的积累水平都比野生型ToLCHsV低。（2）AC2与AC4抑制转录后基因沉默（Post-Transcriptional Gene Silencing,PTGS）和转录水平的基因沉默（Transcriptional Gene Silencing,TGS）的活性:为判定ToLCHsV的AC2和AC4是否具有PTGS抑制子活性,本研究将这两个蛋白的ORF分别构建到了瞬时表达载体pEarlyGate100,获得pEarlyGate100-AC2与pEarlyGate100-AC4。将pEarlyGate100-AC2与pEarlyGate100-AC4以农杆菌注射的方式分别与一个表达GFP mRNA的二元载体（35S-GFP）共同导入16c本氏烟叶片后观察GFP荧光情况,并检测GFP mRNA积累水平。结果表明AC4能显著抑制PTGS的发生,而AC2没有这种功能。（3）AC2与AC4的亚细胞定位和它们增强异源病毒侵染的能力:为明确ToLCHsV AC2与AC4的的亚细胞定位,本研究将AC2/AC4的ORF分别构建到pEarlyGate101载体,获得能表达AC2/AC4-YFP融合蛋白的二元载体pEarlyGate101-AC2/AC4。将pEarlyGate101-AC2和pEarlyGate101-AC4以农杆菌注射的方式分别导入本氏烟叶表皮细胞,并在导入后的第二天利用共聚焦显微镜观察YFP荧光在细胞中的分布。结果表明,AC2-YFP在细胞质和细胞核中都有分布,而AC4-YFP主要定位于细胞质的叶绿体中。为研究ToLCHsV AC2与AC4是否能增强异源病毒的侵染,本研究以PVXAC2和PVX-AC4分别接种本氏烟。结果表明,ToLCHsV AC2与AC4都能显著增强PVX的致病性,并能大幅提升PVX在本氏烟中的积累水平。在增强PVX致病性和积累水平上,AC2比AC4活性更强。综上,本研究加深了我们对ToLCHsV AC2与AC4基因功能的认识,为解析ToLCHsV的侵染机理奠定了基础。另外,本研究发现AC2对ToLCHsV的侵染不是必须的,且ToLCHsV的AC4定位于叶绿体,这两点与之前报道的其它begomoviruses的情况明显不同。因此,本研究也为全面认识begomoviruses AC2与AC4的基因功能提供了新的视角。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第一章前言

1.1 双生病毒概述及研究进展

1.1.1 双生病毒的概述

1.1.2 Begomovirus概述

1.2 Begomovirus AC2/C2与AC4/C4 研究进展

1.2.1 Begomovirus AC2/C2 的基因功能研究

1.2.2 Begomovirus AC4/C4 的研究进展

1.3 本研究的目的和意义

第二章 AC2、AC4在ToLCHsV侵染中的作用研究

2.1 实验材料与试剂

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验试剂

2.2 方法

2.2.1 ToLCHsV突变体侵染性克隆载体的构建

2.2.2 突变体质粒的农杆菌转化

2.2.3 农杆菌注射本氏烟

2.2.4 病毒积累量

2.3 结果与分析

2.3.1 ToLCHsV三个突变体的获得

2.3.2 ToLCHsV三个突变体的侵染性分析

2.3.3 病毒积累量检测

2.3.4 ToLCHsV三个突变体侵染本氏烟中PR1 的表达量检测

2.4 小结

第三章 AC2与AC4 的沉默抑制活性

3.1 实验材料与试剂

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验试剂

3.2 实验方法

3.2.1 载体构建

3.2.2 农杆菌注射16C/16C-TGS转基因本氏烟

3.2.3 GFP相对表达量的测定

3.3 结果分析

3.3.1 目的载体的获得

3.3.2 AC2/AC4 PTGS抑制子活性鉴定

3.4 小结

第四章 AC2与AC4 亚细胞定位及其对PVX的致病性影响研究

4.1 实验材料与试剂

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验试剂

4.2 实验方法

4.2.1 Gateway入门及载体的构建

4.2.2 农杆菌转化

4.2.3 农杆菌注射本氏烟

4.2.4 PVX相对表达量的测定

4.3 结果分析

4.3.1 AC2与AC4 亚细胞定位载体的获得

4.3.2 AC2与AC4 的亚细胞定位

4.3.3 AC2与AC4对PVX致病性的影响

4.4 小结

第五章总结与展望

5.1 全文总结

5.2 讨论与展望

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 谢国辉

导师: 吴祖建,杜振国

关键词: 菜豆金黄花叶病毒属,新竹番茄曲叶病毒,基因功能

来源: 福建农林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,植物保护

单位: 福建农林大学

分类号: S432.41

总页数: 68

文件大小: 5143K

下载量: 39

新竹番茄曲叶病毒AC2与AC4的功能研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢