王颖[1]2003年在《天然食品防腐剂人溶菌酶编码基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达》文中研究指明人溶菌酶是存在于人体正常体液和组织中的一种非特异性免疫因子。它对人体完全无毒副作用，同时具有抗菌、消炎、抗病毒、抗肿瘤等作用，可被开发成口含片、胶囊、口香糖及口腔喷雾剂等产品形式。 由于人溶菌酶来源有限，因此本研究提出通过遗传工程方法，利用毕赤酵母细胞生产人溶菌酶，一方面解决了人溶菌酶资源稀缺的问题，另一方面则能创造更大的经济效益。由于人胎盘组织中富含hLZM基因的mRNA，因此从人胎盘组织中提取细胞总RNA作为模板，根据GENEBANK中已发表的hLZM基因的cDNA序列，设计合成特异引物，经逆转录合成hLZM基因的cDNA序列，并以此cDNA序列为模板，经PCR扩增hLZM编码基因。经DNA序列分析证明与已发表的hLZM cDNA序列完全一致。 通过EcoRⅠ和NotⅠ双酶切作用，将hLZM的编码基因按照质粒阅读框的转译方向插入到表达质粒pPIC9K的MCS中，构建重组表达质粒pPIC9K／hLZM。利用电转化方法转化表型为His~-的宿主菌KM71，利用MD培养基筛选到近1 200个His~+转化子。再经G418抗性的二次筛选，获得15株含高拷贝人溶菌酶基因的重组毕赤酵母转化子。当以甲醇进行诱导表达时，成功获得了1株高效分泌表达的重组菌株Pp135，其表达量为317mg／L，酶活性为32035u／mL。 菌株Pp135经甲醇诱导，可将人溶菌酶分泌到培养基中，因此可在发酵上清液中直接检测到人溶菌酶的活性。该检测采用以溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)为试验菌的琼脂平板扩散法。研究发现培养基BGMM、BMM、MMC等均能诱导菌株Pp135表达人溶菌酶，由于培养基BGMM和MMC中存在干扰溶菌酶纯化的杂蛋白，并使溶菌酶产品带有异味和色素，因而确定利用BMM培养基进行重组菌株Pp135的诱导表达。实验最终获得381mg／L的表达量，若继续优化发酵条件，还有可能进一步提高菌株Pp135的表达水平。 本研究为人溶菌酶的工业化规模生产奠定理论基础，这对带动人溶菌酶的规模化生产具有特殊意义，其推广应用将给社会带来相当的经济效益。
龚标[2]2013年在《人溶菌酶在毕赤酵母中的高效表达与抗菌活性研究》文中指出溶菌酶(lysozyme, LYZ)是一种生物活性小分子碱性蛋白,因具有溶解细菌细胞壁导致细菌溶解的作用特性而得名。溶菌酶广泛存在于微生物、植物、动物和人体中,在机体的非特异性天然免疫中作为效应分子发挥重要作用。具有抗原性弱、稳定性强、抗菌机理独特、不易产生耐药性及进入机体无有害残留等特点。与其它溶菌酶相比,人溶菌酶(human lysozyme, Hlys)具有稳定性好、溶菌活性强等优势。目前人溶菌酶主要从人乳和胎盘中获取,这种方法产量低、成本高,极大地限制了人溶菌酶的应用,实现人溶菌酶的大量高效表达显得尤为重要。本研究通过基因工程方法,利用毕赤酵母表达系统高效表达人溶菌酶。在GenBank数据库中查看人溶菌酶基因(FJ795023.1)序列,按照毕赤酵母密码子偏嗜性重新设计并合成人溶菌酶基因,通过EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切将人溶菌酶基因连接到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZaA,得到重组质粒pPICZaA-Hlys; SacI线性化pPICZaA-Hlys后,电转化毕赤酵母GS115菌株感受态细胞,在Zeocin抗性浓度为100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPD平皿筛选重组菌。根据pPICZaA的醇氧化酶启动子设计上下游引物：5'-AOX1和3'-AOX1引物,PCR鉴定阳性重组子,共筛选出6株含目的基因的重组菌株。将重组菌株以甲醇作为碳源进行诱导,SDS-PAGE和Western blot检测到培养基上清中Hlys蛋白的表达。选取表达效果最好的6号重组菌,对摇瓶上的诱导条件进行优化,得出最佳的诱导条件为：pH=7.0,诱导时间72h,甲醇浓度2%。在发酵罐上按照摇瓶诱导的最佳诱导条件进行目的蛋白的大量表达研究,SDS-PAGE检测显示上清中可检测到目的蛋白的表达。电泳凝胶分析表明目的蛋白占总蛋白的30.5%,BCA法测得目的蛋白表达量约为669.78μg/mL/。发酵诱导上清浓缩处理,体外抑菌试验表明重组人溶菌酶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌都有一定的抑菌作用。重组人溶菌酶对多株链球菌的最低抑菌浓度(MIC)范围为96～192μg/mL,最低杀菌浓度(MBC)范围为383～766gg/mL。重组人溶菌酶对多株副猪嗜血杆菌的MIC范围为383～766μg/mL, MBC在766μg/mL以上。发酵上清经超滤浓缩、SephadexG-50凝胶层析分离纯化得到较纯的人溶菌酶蛋白。以溶壁微球菌为底物,快速比浊法测得表达的重组人溶菌酶酶活力为3847.93U/mL,计算得比活力为19233.20U/mg。发酵液中添加冻干保护剂,冷冻干燥,干粉添加在饲料中饲喂小鼠一周,饲料中添加溶菌酶的小鼠体重比未添加组增加3.97%,但是两组间差异不显着。小鼠动物试验结果表明重组人溶菌酶对链球菌感染有一定的预防作用,但治疗效果不明显。
参考文献：
[1]. 天然食品防腐剂人溶菌酶编码基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[D]. 王颖. 中国农业大学. 2003
[2]. 人溶菌酶在毕赤酵母中的高效表达与抗菌活性研究[D]. 龚标. 华中农业大学. 2013