聚合物点荧光性质调控及超分辨荧光成像研究

论文摘要

随着人类对生命的认知进一步深入,当前对构成生物体的最小单元—细胞的活动过程仍在探索学习中。在生命科学以及生物医学领域内,通常借助显微镜进行细胞层面的研究,宽场光学显微镜由于受到光的衍射极限,不能够无限分辨空间位置相距小于200 nm的物体。然而,细胞中的诸多细胞器以及分子结构的尺寸在1-50 nm。这已经远远超出了远场光学显微镜的分辨能力。自1873年德国科学家Ernst Abbe提出光学衍射极限的一个多世纪后,诸多不同工作原理的超分辨光学荧光显微镜被开发出来。常用的超分辨率显微技术主要分为四大类,有基于调制点扩散函数的受激发射损耗显微术（STED）和结构光照明成像技术（SIM）;基于有机染料或者荧光蛋白光开关特性的随机光学重构显微术（STORM）和光激活定位显微术（PALM）;基于荧光探针光闪烁特性的超分辨光学涨落成像（SOFI）以及基于样品膨胀的扩大显微术（ExM）等典型的超分辨荧光成像技术。典型的超分辨荧光成像技术都依赖于荧光探针的光学性质,常用的有机荧光小分子染料和荧光蛋白的荧光亮度以及抗光漂白特性等在长时成像应用中有待进一步提高。聚合物点作为新一代荧光探针,因其较高的荧光亮度、较大的吸收截面、较好的抗光漂白特性及生物兼容性,在细胞成像、生物传感以及光学治疗等方面取得广泛应用。因此将聚合物点应用到超分辨光学成像中具有重要意义。本文主要取得如下创新性结果:（1）通过Fo?rster共振能量传递（FRET）调控聚合物点（Pdots）合作闪烁发光并应用到SOFI成像中。制备PFO-Coumarin6和CNPPV-NIR695两种合作闪烁发光Pdots。通过调节染料受体的比例,得到最佳掺杂比并避免了染料聚集引起淬灭的现象。荧光光谱、单粒子荧光光谱以及单粒子荧光强度随时间变化的曲线表明,两种Pdots具有较好的荧光闪烁特性。合作闪烁发光Pdots荧光“亮态”来自荧光染料,而“暗态”来自聚合物供体。因FRTE对供体和受体的荧光光谱交叠以及距离极其敏感,激发光照射下Pdots产生随机游走的空穴极化子破坏了聚合物向染料的能量传递过程造成染料掺杂Pdots的荧光关闭。单粒子SOFI结果表明,四阶SOFI图像中空间分辨率为68 nm,与普通宽场显微成像相比提高了5.3倍。对合作闪烁发光Pdots进行表面功能化实现对亚细胞结构的特异性标记,实现空间分辨率为90 nm的四阶SOFI成像。（2）基于窄带荧光发射Pdots的双色高阶SOFI成像。开发了两种荧光发射光谱较窄（小于50 nm）的聚合物点PF5BODIPY565和PF8BODIPY720 Pdots。根据发射光谱匹配程度,选择市售染料Alexa555和Alexa647进行比较,窄带发射Pdots具有较高的单粒子荧光亮度和单粒子荧光抗漂白特性。两种窄带发光Pdots具有较好的单粒子荧光闪烁特性,其荧光“暗态”时间分布符合“幂律”分布拟合。SOFI成像的分辨率随着对荧光图像序列中像素上的荧光强度波动函数的互累积量的阶数增加而提高。本章实验计算八阶互累积量得到SOFI重建图像,PF5BODIPY565单粒子八阶SOFI得到了57 nm的空间分辨率,分辨率是普通宽场成像的6倍。PF5BODIPY565 Pdots标记的BS-C-1细胞微管八阶SOFI超分辨图像中,实现了微管结构61 nm的空间分辨率,和普通宽场相比高了五倍。该分辨率为基于Pdots荧光探针标记微管结构SOFI图像的最佳分辨率。PF8BODIPY720 Pdots标记的BS-C-1微管和细胞线粒体膜结构在八阶SOFI下分别实现了67 nm和70 nm的空间分辨率。通过优化标记步骤,成功实现了基于窄带荧光发射Pdots对BS-C-1细胞乙酰化微管和线粒体膜结构的双色八阶SOFI成像并得到了101 nm的空间分辨率。（3）实现基于Pdots的STED超分辨荧光成像。将Pdots拓展到了STED技术应用中。实现聚合物的有机溶液在回音廊壁微腔中受激发射,通过调谐微腔的几何尺寸精确的调控了聚合物微腔激光波长。聚合物作为增益介质表现出了超强的光稳定性,在近阈值的泵浦光强度激发下,20 min后聚合物微腔激射的强度几乎无减弱。聚合物的微腔激射为Pdots在STED成像中提供了应用基础。通过与NileRed染料的能量传递,实现了CNPPV-Nilered Pdots特异性标记BS-C-1细胞微管结构的STED超分辨率荧光成像,空间分辨率达到90 nm,比共聚焦模式下提高了2.4倍。

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第1章绪论

1.1 光学显微成像

1.1.1 光学显微镜的发展历史

1.1.2 显微成像的放大倍率

1.1.3 显微成像中的光学分辨率

1.1.4 生物医学中常用的荧光显微镜

1.2 超分辨率荧光成像

1.2.1 基于调制点扩散函数的超分辨率荧光成像

1.2.2 基于单分子定位的超分辨率荧光成像

1.2.3 基于荧光探针闪烁特性的超分辨率成像

1.2.4 基于样品扩大的超分辨率成像

1.3 用于光学超分辨率成像的荧光探针

1.3.1 无机半导体量子点

1.3.2 有机小分子荧光染料

1.3.3 荧光蛋白分子

1.3.4 碳点

1.3.5 光频率上转换纳米粒子

1.3.6 聚集诱导发光材料

1.3.7 有机共轭聚合物点

1.4 本论文选题意义及主要内容

第2章合作闪烁发光聚合物点用于超分辨光学涨落成像

2.1 引言

2.2 实验材料及方法

2.2.1 实验试剂及仪器

2.2.2 合作闪烁发光Pdots的制备

2.2.3 合作闪烁发光Pdots的表征方法

2.2.4 合作闪烁发光Pdots单粒子荧光性质测试

2.2.5 合作闪烁发光 Pdots 单粒子 SOFI 实验

2.2.6 合作闪烁发光Pdots的生物偶联

2.2.7 合作闪烁发光Pdots的亚细胞结构特异性标记

2.2.8 合作闪烁发光 Pdots 的亚细胞结构 SOFI 实验

2.3 实验结果与讨论

2.3.1 合作闪烁发光Pdots的基本性质

2.3.2 合作闪烁发光Pdots单粒子荧光性质及SOFI成像

2.3.3 合作闪烁发光Pdots的亚细胞结构特异性标记及SOFI成像

2.4 结论

第3章窄带发射聚合物点用于高阶超分辨光学涨落成像

3.1 引言

3.2 实验材料及方法

3.2.1 实验试剂及仪器

3.2.2 窄带发射Pdots的制备

3.2.3 窄带发射Pdots基本性质测试

3.2.4 窄带发射Pdots单粒子荧光测试

3.2.5 窄带发射 Pdots 单粒子 SOFI 实验

3.2.6 窄带发射Pdots的生物偶联

3.2.7 窄带发射Pdots的亚细胞结构特异性标记

3.2.8 窄带发射 Pdots 的 SOFI 实验

3.3 实验结果与讨论

3.3.1 窄带发射Pdots的制备及表征

3.3.2 基于窄带发射Pdots的单粒子SOFI

3.3.3 基于窄带发射Pdots的亚细胞结构单色SOFI

3.3.4 基于窄带发射Pdots亚细胞结构多色SOFI

3.4 结论

第4章染料掺杂的聚合物点在受激发射损耗显微成像中的应用

4.1 引言

4.2 实验材料及方法

4.2.1 实验试剂及仪器

4.2.2 回音壁微腔的制备及测试

4.2.3 染料掺杂的Pdots的制备及测试

4.2.4 染料掺杂的Pdots细胞特异性标记及STED测试

4.3 实验结果与讨论

4.3.1 基于半导体共轭聚合物的荧光受激发射

4.3.2 CNPPV-Nilered量子点的表征

4.3.3 CNPPV-Nilered Pdots的亚细胞结构STED成像

4.4 结论

第5章结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

作者简介及科研成果

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘志贺

导师: 吴长锋

关键词: 聚合物点,超分辨光学涨落成像,受激发射损耗显微镜,能量传递,细胞标记,微腔激光器

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,信息科技

专业: 生物学,计算机软件及计算机应用

单位: 吉林大学

分类号: TP391.41;Q6-33

总页数: 147

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