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CRISPR/Cpf1技术编辑二倍体马铃薯基因组的研究

2020-12-02阅读(448)

CRISPR/Cpf1技术编辑二倍体马铃薯基因组的研究

论文摘要

在植物的基因组进行定点编辑对农作物的遗传改良具有重要意义。目前,CRISPR/Cas9系统因其简便性和高效性已被广泛应用于包含马铃薯在内的多种作物的基因组编辑。然而,由于CRISPR/Cas9系统仅能识别PAM序列为5’-NGG-3’的前导序列,极大限制了其定点编辑的适用范围,因此如何扩展CRISPR系统的编辑范围是目前基因编辑领域一个重要的研究方向。CRISPR/Cpf1是一类新型CRISPR系统,其可特异识别PAM序列为5’-TTTN-3’后面的24 bp,这极大丰富了CRISPR系统对靶标位点的选择范围,因而其也成为继CRISPR/Cas9系统后又一研究热点。然而CRISPR/Cpf1系统在茄科作物中的研究还不是很深入,在马铃薯中的应用就未见报道,因此本论文拟针对CRISPR/Cpf1系统在马铃薯中的应用进行系统的研究。首先,本论文根据前人的研究基础,分别对Cpf1蛋白的两个变体LbCpf1和AsCpf1进行了基于双子叶植物的密码子优化,然后针对CrRNA的表达系统,构建了4套优化表达体系:核酸酶介导的RIBO系统,基于Cys4的CrRNA切除的Csy4系统,多顺反子RNA表达的T-RNA系统,以及Cpf1介导CrRNA切割的DR系统。之后,对上述2种Cpf1蛋白变体和4种CrRNA表达体系进行组合,共构建了8套可以在马铃薯中转化的方案。为了高通量验证基因编辑的实验方案。本论文首先在二倍体马铃薯中建立了一套发根农杆菌转化体系。此体系操作简单、转化周期短（最快6天可获得阳性根）,还可通过可视化荧光筛选高效鉴定阳性转化根。为了验证此套体系的可行性,本论文选取马铃薯StCDF1基因的2个靶点,利用CRISPR/Cas9系统对其进行了检测。检测结果显示选取的2个靶点在发根体系中均检测到了高效的突变效率,之后本论文选取了一个效率最高的靶点,用转基因实验进行了验证,结果也在后代转基因阳性植株中鉴定到了缺少5 bp的杂合突变体,这说明该体系可用于基因编辑载体的快速验证。最后,本论文利用建立的发根农杆菌转化体系对8套CRISPR/Cpf1实验方案依次进行了一代测序检测。检测结果显示,基于AsCpf1的Csy4表达CrRNA的体系鉴定到了2条阳性突变荧光根。对所有阳性荧光根进行进一步的深度测序分析后发现,AsCpf1的Csy4表达CrRNA的体系的两条荧光根中的基因组发生了突变。这验证了CRISPR/Cpf1系统能够编辑马铃薯的基因组。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 术语及符号说明
  • 第一章 文献概述
  •   1.1 CRISPR概述
  •     1.1.1 CRISPR发展历史与CRISPR/Cas9 简介
  •     1.1.2 CRISPR/Cpf1 系统简介
  •     1.1.3 CRISPR/CrRNA表达系统简介
  •     1.1.4 氨基酸球菌和毛螺科菌来源的Cpf1 蛋白晶体结构上的异同
  •     1.1.5 CRISPR在马铃薯中的应用
  •   1.2 马铃薯概述
  •     1.2.1 马铃薯的发展及其重要意义
  •     1.2.2 光周期与StCDF1 基因控制马铃薯的熟性
  •     1.2.3 二倍体马铃薯材料对于本研究的意义
  •   1.3 马铃薯转化体系简介
  •     1.3.1 马铃薯根癌农杆菌的遗传转化机理
  •     1.3.2 马铃薯根癌农杆菌转化体系
  •     1.3.3 马铃薯发根杆菌转化体系
  •     1.3.4 发根农杆菌转化与根癌农杆菌介导马铃薯转化比较
  •   1.4 本研究的目的及意义
  • 第二章 载体的设计与构建
  •   2.1 实验的材料与药品试剂准备
  •     2.1.1 使用的菌种
  •     2.1.2 原始载体
  •     2.1.3 药品试剂
  •     2.1.4 常用细菌类培养基（表2.1）
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 StCDF1 基因的克隆
  •     2.2.2 骨架载体的改造
  •     2.2.3 StCDF1-CRISPR Cas9 载体的构建
  •   2.3 CRISPR/AS-Cpf1与CRISPR/LB-Cpf1 的载体组装
  •     2.3.1 CPF1 蛋白与其他载体元件大片段的合成
  •     2.3.2 CrRNA表达元件的合成
  •     2.3.3 CRISPR/Cpf1 系统的拼接与组装
  •     2.3.4 Cpf1 系列载体的靶点选择
  •     2.3.5 实验结果
  • 第三章 二倍体马铃薯基因编辑载体快速验证体系优化
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 植物材料
  •     3.1.2 菌株
  •     3.1.3 试剂配置
  •     3.1.4 常用培养基（表3.1）
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 发根农杆菌的转化
  •     3.2.2 二倍体马铃薯无菌苗的培养
  •     3.2.3 马铃薯外植体的预培养
  •     3.2.4 发根农杆菌的准备与侵染以及暗培养
  •     3.2.5 发根培养基的抗性筛选
  •     3.2.6 荧光根的筛选
  •     3.2.7 CTAB法提取植物基因组DNA
  •     3.2.8 二倍体马铃薯荧光根的遗传转化鉴定
  •     3.2.9 二倍体马铃薯目的基因编辑的检测
  •   3.3 二倍体马铃薯根癌农杆菌转化与StCDF1 基因突变体植株的获得
  •     3.3.1 根癌农杆菌的制备与遗传转化
  •     3.3.2 愈伤组织的诱导分化与抗性植株的筛选
  •     3.3.3 突变体的鉴定
  •   3.4 结果与分析
  •     3.4.1 二倍体马铃薯发根转化体系中生根培养基的优化结果与分析
  •     3.4.2 二倍体马铃薯转化体系荧光根的筛选结果
  •     3.4.3 二倍体马铃薯发根转化体系对于基因编辑载体的高效验证
  •     3.4.4 二倍体马铃薯转化体系筛选荧光根中对于靶点的编辑情况
  •     3.4.5 二倍体马铃薯StCDF1 功能缺失突变体植株的获得
  •   3.5 讨论
  • 第四章 CRISPR/Cpf1 系统在马铃薯中的验证
  •   4.1 实验材料与方法
  •     4.1.1 发根农杆菌的遗传转化快速验证AsCpf1与LbCpf1 系统
  •     4.1.2 荧光手电筒的高通量阳性荧光根
  •   4.2 根癌农杆菌稳定遗传体系验证As/Cpf1与Lb/Cpf1 系统的尝试
  •     4.2.1 Cpf1 根癌农杆菌的遗传转化
  •     4.2.2 转基因植株的筛选
  •     4.2.3 对基因编辑的样本进行深度低频率的检测
  •   4.3 结果与分析讨论
  •     4.3.1 荧光手电对于二倍体马铃薯发根遗传转化的高筒量的筛选
  •     4.3.2 AsCpf1与LbCpf1 在二倍体马铃薯中发根转化体系的编辑效率结果
  •     4.3.3 AsCpf1与LbCpf1 在二倍体马铃薯中根癌农杆菌转化体系编辑效率结果
  •     4.3.4 结果分析与讨论
  • 第五章 全文总结
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 蒋继滨

    导师: 黄三文,尚轶

    关键词: 系统,二倍体马铃薯,发根农杆菌

    来源: 云南师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,农作物

    单位: 云南师范大学

    分类号: S532;Q943.2

    总页数: 58

    文件大小: 1604K

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