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类弹性蛋白的设计、制备与性能研究

2020-12-08阅读(904)

类弹性蛋白的设计、制备与性能研究

论文摘要

类弹性蛋白（Elastin-Like Polypeptides,ELPs）是一种参照弹性蛋白中高度重复序列、通过基因工程技术构建的由五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly（VPGXG）n串联重复而成的多肽,其中Xaa称为客座残基,是除了Pro以外的任意一种氨基酸,Xaa和重复次数n不同,则ELPs不同。ELPs与天然弹性蛋白相似,具有良好的细胞相容性,在体内可降解为天然氨基酸,免疫排斥反应低。当外界温度低于相变温度时,ELPs处于溶解状态,当外界温度高于相变温度（Transition temperature,Tt）时,ELPs自动聚集,从溶液中析出形成沉淀,该特性被称为相转变特性,已被广泛用于组织工程材料、药物靶向递送和蛋白纯化研究。课题组的前期工作已经构建了多种序列组成ELPs,但是其相转变温度较高,用作药物递送载体或组织工程材料的潜力不大,也难以实现廉价的相变循环纯化。因此,本课题的目的是在文献资料基础上,设计、构建、筛选相转变温度较低、生物相容性较好的ELPs,为研制药物靶向递送载体、组织工程材料分子奠定基础。目的:筛选出相变温度接近体温、生物活性较好的ELPs。方法:（1）根据文献报道,重新设计合成氨基酸序列和肽链长度不同的的ELPs;（2）利用RDL技术构建、筛选出符合要求的ELPs原核表达载体（50倍体和90倍体）;（3）利用大肠杆菌表达、制备不同ELPs;（4）通过小鼠成纤维细胞L929细胞增殖和迁移分析不同ELPs的活性;（5）在创伤动物模型上分析不同ELPs损伤修复活性。结果:（1）双酶切检测结果显示,不同序列的ELP50s和ELP90s被插入突变的pUC18克隆载体和表达载体pET28a（+）的Nco Ⅰ和Xho Ⅰ位点之间;（2）SDS-PAGE分析检测结果显示,18种不同的ELPs均可在IPTG诱导下以可溶状态在E.coliBL21（DE3）细胞中表达积累;（3）使用ITC法纯化目的蛋白,可获得纯度在90%以上的ELPs重组蛋白;（4）小鼠成纤维细胞L929的增殖及迁移实验结果表明,ELP①-50、ELP⑥-50对小鼠成纤维细胞具有明显的增殖作用,ELP①-50、ELP①-90、ELP④-50、ELP④-90、ELP⑦-50、ELP⑦-90、ELP⑧-50和HLC对小鼠成纤维细胞L929的迁移能够起到明显的促进作用;（5）小鼠皮肤缺损修复实验结果显示,ELP①-50和ELP⑦-90能够明显促进小鼠皮肤缺损的修复,且其1%浓度时的相转变温度分别为40℃和35℃。结论:研究获得了两种相转变温度较低、生物活性较好的ELPs即ELP①-50和ELP⑦-90,为研制靶向药物递送载体和组织工程材料分子奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略语对照表
  • 1 绪论
  •   1.1 类弹性蛋白概述
  •     1.1.1 弹性蛋白简介
  •     1.1.2 类弹性蛋白简介
  •   1.2 类弹性蛋白的主要特点
  •   1.3 类弹性蛋白的相变机制
  •     1.3.1 热力学
  •     1.3.2 动力学
  •     1.3.3 结构变化
  •   1.4 类弹性蛋白相变温度的影响因素
  •     1.4.1 氨基酸组成、肽链长度及排列顺序
  •     1.4.2 溶液的离子强度和pH
  •     1.4.3 蛋白溶液的浓度
  • t值的应用'>  1.5 ELPs的Tt值的应用
  •     1.5.1 在肿瘤治疗中的应用
  •     1.5.2 在药物胶束载体构建中的应用
  •     1.5.3 在蛋白质纯化中的应用
  •     1.5.4 ELPs在组织工程中的应用
  •   1.6 实验目的和设计
  • 2 材料与方法
  •   2.0 实验仪器
  •   2.1 实验材料
  •   2.2 实验试剂
  •   2.3 试剂配制
  •   2.4 细胞、菌株、质粒及动物
  •   2.5 目的基因合成及酶切位点设计
  •     2.5.1 ELPs序列设计及合成
  •     2.5.2 酶切位点设计
  •   2.6 实验方法
  •     2.6.1 pUC18载体的定点突变
  •     2.6.2 E.coli Top10、E.coli BL21（DE3）感受态细胞的制备
  •     2.6.3 转化
  •     2.6.4 质粒提取
  •     2.6.5 质粒的酶切
  •     2.6.6 目的片段的切胶回收
  •     2.6.7 目的片段与载体连接重组及重组子的筛选
  •     2.6.8 ELPs的表达及菌种保存
  •     2.6.9 可溶性分析
  •     2.6.10 ELP50和ELP90的大规模发酵
  •     2.6.11 菌体的破碎
  •     2.6.12 相变纯化（ITC纯化）
  •     2.6.13 蛋白透析除盐
  •     2.6.14 ELP50s及ELP90s的冻干保存
  •     2.6.15 ELP50s及ELP9s0冻干膜片的形貌观察
  •     2.6.16 ELPs的相变温度测定
  •     2.6.17 细胞复苏、传代及冻存
  •     2.6.18 ELP50s、ELP90s及类人胶原蛋白浓度测定
  •     2.6.19 细胞增殖实验
  •     2.6.20 细胞迁移实验
  •     2.6.21 小鼠皮肤缺损修复实验
  •     2.6.22 小鼠新生皮肤的石蜡切片
  •     2.6.23 小鼠新生皮肤染色
  • 3 实验结果及分析
  •   3.1 pUC18载体的突变
  •     3.1.1 BglⅠ单酶切验证
  •     3.1.2 Nco 1 & Xho 1双酶切验证
  •     3.1.3 多克隆位点完整性鉴定
  •     3.1.4 pUC18克隆载体突变测序结果
  •   3.2 pUC18-ELPs10～90克隆载体的构建及酶切验证
  •     3.2.1 pUC18-ELP①（VPGVG）n（n=10～90）克隆的载体构建
  •     3.2.2 pUC18-ELP②-10～ELP②-90等克隆载体的构建
  •   3.3 ELP50s和ELP90s表达载体的构建及酶切检测
  •   3.4 ELP50s和ELP90s在E.coli BL21（DE3）中的表达及可溶性分析
  •     3.4.1 pET28a（+）-ELP①-50和pET28a（+）-ELP①-90的表达及可溶性分析
  •     3.4.2 ELP50s和ELP90s的表达及可溶性分析
  •   3.5
  •     3.5.1 ELP①-50和ELP①-90 ITC纯化
  •     3.5.2 ELP50s和ELP90s的ITC纯化
  •     3.5.3 ELP50s和ELP90s相变温度测定
  •   3.6 ELP50s和ELP90s活性检测及其在小鼠皮肤缺损修复中的作用
  •     3.6.1 ELP50s和ELP90s蛋白冻干形貌观察
  •     3.6.2 ELP50s和ELP90s对小鼠成纤维细胞增殖能力检测
  •     3.6.3 ELP50s和ELP90s对小鼠成纤维细胞迁移能力的影响
  •     3.6.4 ELP50s和ELP90s对小鼠皮肤缺损修复能力检测
  •     3.6.5 小鼠新生皮肤的石蜡切片、HE染色及Masson染色
  • 4 总结
  •   4.1 ELP50s和ELP90s克隆载体的构建
  •   4.2 ELP50s和ELP90s表达载体的构建
  •   4.3 ELP50s和ELP90s的诱导表达及可溶性分析
  •   4.4 ELP50s和ELP90s的大规模发酵及ITC纯化
  •   4.5 ELP50s和ELP90s的活性检测
  •   4.6 ELP50s和ELP90s的相转变温度
  •   4.7 实验中存在的不足
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间取得的科研成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 卫思丽

    导师: 李红民

    关键词: 类弹性蛋白,设计,表达纯化,相变温度,性能研究

    来源: 西北大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 西北大学

    分类号: Q78

    总页数: 74

    文件大小: 4147K

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