论文摘要
研究背景:伊蚊传播的疾病,如登革热,寨卡和基孔肯雅热,正在成为全球重大的公共卫生突发事件,而黄热病等旧的威胁也正在重新出现。白纹伊蚊作为一种重要的传病媒介,已经扩散到除南极洲以外的其他大陆,呈现全球扩散的严峻态势,已经成为最危险的100种入侵物种之一。由于缺乏安全有效的疫苗和特效药物,长期以来蚊媒种群防制是蚊媒传染病防控的关键部分,蚊媒种群防制主要有种群减少和种群替换。种群减少的主要手段就是通过施用化学杀虫剂来减少蚊媒种群或通过去除幼虫孳生地来防止蚊虫繁殖。然而随着化学杀虫剂的大量使用,蚊虫对杀虫剂抗性的相继升高,近年来蚊媒传染病的感染率逐年攀升,环境污染等问题也相继出现。由于蚊浓核病毒（Mosquitodensovirus,MDV）特异感染蚊类及其生活史的特性,让其具有成为高效安全生物杀蚊剂的潜力。发展MDV为新型生物杀蚊剂将为蚊媒传染病的生物防制提供一种新的思路。由于野生型MDV存在作用时间长,毒性弱的特点,对其进行基因重组,增强对蚊虫的致病性是一种可行的办法。前期的研究中,在MDV中引入了蝎毒基因和小干扰RNA以增强杀蚊效果,然而随着外源基因的引入,该病毒也丧失了自主复制能力,而这也是蚊浓核病毒发展为生物杀蚊剂的瓶颈。由于蚊媒传染病毒通过雌蚊吸血传播,控制雌蚊种群数量是蚊媒防制方法的核心,目前基于释放绝育转基因蚊减少野外蚊虫种群来控制登革热等蚊媒传染病的遗传策略已经进行了尝试并取得了成功。课题组前期研究已证实白纹伊蚊AalNix是雄性特异基因却具有复杂的基因结构,但是AalNix的功能还有待进一步研究。C6/36来自于雄性白纹伊蚊,然而C6/36细胞是否可作为性别决定机制研究的模型也尚不明确。目的:1.利用内含子内小RNA的表达策略,构建表达内源miRNA（Endengous miRNAs）,miRNA 海绵（miRNA sponge）以及人工 miRNA（Artifitial miRNA,amiRNA）的MDV载体。重组MDV特异感染进入蚊细胞,分别诱导内源miRNA的过表达和沉默,以及诱导内源靶基因沉默。2.比较sgRNA在C6/36与白纹伊蚊胚胎中对AatNix的敲除效率;探究AalNix在C6/36细胞内是否参与调控性别决定通路,以明确C6/36细胞是否适合进行AalNix调控性别决定通路的研究;探究AalNix敲除是否导致雄性内生殖器的畸形和雌性化,进一步阐明AalNix在白纹伊蚊雄性发育中的功能。方法:1.利用内含子内小RNA的表达策略,分别构建表达miRNA,miRNA海绵和amiRNA的重组MDV载体。评估重组MDV中的人工内含子在蚊细胞内的剪接效率,并分别在蚊体内外验证重组MDV对内源性miRNA的过表达和沉默效果。透射电镜检测重组MDV病毒的完整性。PCR和DNA测序检测大肠杆菌stbl3株和C6/36细胞内重组MDV载体和重组MDV的遗传稳定性。qPCR检测重组MDV在C6/36细胞内以及白纹伊蚊幼虫孳生水体中的病毒增殖情况。2.针对AalNix外显子1设计sgRNA,构建同时表达相应sgRNA和Cas9的载体并转染入C6/36细胞测试各sgRNA的基因编辑效率。在AalNix中敲入RFP和Puromycin抗性基因,药筛和流式细胞术分选富集AalNix缺陷细胞,RT-qPCR检测aaldsxF和aalfruF的表达。体外合成的sgRNA与Cas9蛋白共注射白纹伊蚊胚胎,解剖性别表型异常成蚊观察其内生殖器形态,HRMA和测序验证AalNix的敲除效率,并分别检测doublesex和fruitless雌性和雄性剪接体的表达量。结果:1.成功构建了非缺陷型MDV载体和表达荧光的重组缺陷型MDV载体。重组病毒载体转染C6/36后,人工内含子可发生高效的剪切,感染蚊幼虫后,病毒可在体内播散。内含子内miRNA表达策略的MDV成功在蚊体内外分别促进了miR-210和let-7的高表达。内含子内miRNA海绵表达策略的MDV在蚊体内外分别诱导了 miR-210和let-7的沉默。内含子内amiRNA表达策略的MDV在蚊体内外诱导了靶基因V-ATpase基因沉默。重组MDV透射电镜下检测到完整病毒,感染C6/36和幼虫后,增殖能力与野生MDV无差异。重组MDV载体和重组MDV具有遗传稳定性。2.成功构建了 5个sgRNA的表达载体,其中sgRNA1和sgRNA2对AalNix具有基因编辑活性,sgRNAl的突变率为10.00%（4/40）,sgRNA2的突变率为17.50%（7/40）。C6/36敲除AalNix后,aaldsxF和aalfruF的表达量均呈升高趋势。sgRNA1,sgRNA2和Cas9蛋白共注射白纹伊蚊胚胎,检测到36只畸形和雌性化表型的成蚊,其中大多数个体的的内生殖器也发生了畸形和雌性化,将其中20只进行HRMA,检测到1只sgRNA1位点熔解曲线异常,15只sgRNA2位点溶解曲线异常。测序的9只表型异常蚊中sgRNA2位点均存在突变,而sgRNA1位点突变仅有3只。sgRNA2的敲除效率高于sgRNA1,这与C6/36细胞中的效果一致。AalNix敲除后,aaldsx和aalfru均呈倾向雌性特异剪接的趋势。结论:1.重组MDV可以诱导内源性miRNA的过表达和沉默,以及通过表达amiRNA在蚊体内外诱导有效的基因沉默。重组MDV具有野生MDV般的增殖和二次传播能力。本研究首次构建了一种非缺陷型重组MDV的miRNA传递系统,该系统可作为蚊类基因功能分析的工具,为应用病毒的转基因共生体（viral paratransgenesis）进行蚊媒防制奠定了基础。2.针对AalNix的sgRNA1和sgRNA2在C6/36细胞和白纹伊蚊胚胎中具有一致的基因敲除效率。C6/36细胞可应用于AalNix对性别决定通路调控的研究。AalNix对雄性内生殖器的发育至关重要,进一步证实AalNix是雄性发育所必需的。尽管白纹伊蚊和埃及伊蚊的分化距离达到七千万年,但是Nix是一个保守的性别决定因子。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 刘培文
导师: 陈晓光
关键词: 非缺陷型蚊浓核病毒,内含子,雄性决定因子,雌性化
来源: 南方医科大学
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,基础医学
单位: 南方医科大学
基金: 国家自然科学基金重点国际合作研究项目(No.81420108024),国家自然科学基金面上项目(No.81672054,81371846),广东省科技计划项目(2016A020251001),广东省自然科学基金团队项目(2014A030312016)
分类号: R384.1
总页数: 136
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标签：非缺陷型蚊浓核病毒论文; 内含子论文; 雄性决定因子论文; 雌性化论文;