首页> 正文

应用CRISPR/Cas9技术在植物乳杆菌中进行基因编辑的研究

2020-12-02阅读(129)

应用CRISPR/Cas9技术在植物乳杆菌中进行基因编辑的研究

论文摘要

乳酸菌是一类与人的身体健康密切相连的微生物。随着完成全基因组测序的乳酸菌种类越来越多,功能性基因的研究也越来越重要。CRISPR/Cas9基因编辑技术由于实验简单、操作容易、节省时间等优势,可以精确、高效地对基因组进行敲除或者修饰,已经在不同物种中迅速发展起来并得到广泛应用,但是在乳酸菌中的研究报道不多。葡糖胺-6-磷酸合成酶（Glucosamine-6-phosphate synthase,GlmS）是氨基已糖代谢途径（HBP）的催化酶,终产物是N-乙酰-D-葡糖胺（GlcNAc）和氨基葡萄糖（GlcN）。本实验室前期研究表明glmS1基因是植物乳杆菌WCFS1编码GlmS的重要基因,glmS1基因缺陷菌在不添加氨基葡糖的培养基中无法生长。本研究将选用glmS1基因作为CRISPR/Cas9基因编辑技术的目的基因,构建并验证植物乳杆菌WCFS1基因编辑系统,为进一步开展更多乳酸菌的功能基因的编辑奠定基础。本研究首先分别成功构建了含Cas9、recT基因的pMT019和含tracrRNA的ptracrRNA两种质粒。随后通过对启动子结构进行优化,确定了含诱导型启动子PSPPQ的pMT023质粒的Cas9基因和recT基因表达量最高,即pMT023质粒诱导1h时Cas9基因相对表达量上调29.58倍,recT基因相对表达量上调2611倍。进而,对WCFS1感受态细胞制备过程进行优化,得出最佳制备条件为OD600=0.3时,加入诱导剂SppIP 30℃诱导 1h。最后利用 MT+GlcNAc（Cm10+Ery10）和 MT（Cm10+Ery10）两种平板进行对比筛选,筛选出的菌株提取全基因组测序。但是,本实验目前尚未筛选到目的突变子。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词表
  • 第一章 绪论
  •   1.1 乳酸菌及其功能基因研究进展
  •     1.1.1 乳酸菌的概述
  •     1.1.2 乳酸菌功能基因的研究
  •   1.2 基因敲除技术
  •     1.2.1 单双交换同源重组
  •     1.2.2 Cre/loxP位点特异性重组
  •     1.2.3 线性转化敲除
  •     1.2.4 温敏性质粒敲除
  •     1.2.5 CRISPR/Cas9系统敲除
  •     1.2.6 常见的乳酸菌表达载体及宿主菌
  •     1.2.7 乳酸菌基因敲除的研究进展
  •   1.3 CRISPR/Cas9系统
  •     1.3.1 CRISPR/Cas系统概述
  •     1.3.2 CRISPR/Cas系统的组成
  •     1.3.3 CRISPR/Cas系统的分类
  •     1.3.4 CRISPR/Cas9工作原理
  •     1.3.5 CRISPR/Cas9系统研究进展
  •     1.3.6 CRISPR/Cas9系统在乳酸菌中的应用现状
  •   1.4 本课题研究内容及意义
  •     1.4.1 本课题研究内容
  •     1.4.2 本课题研究意义
  • 第二章 WCFS1基于CRISPR-Cas9进行基因编辑的质粒构建
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株与质粒
  •     2.1.2 引物
  •     2.1.3 培养基
  •     2.1.4 试剂
  •     2.1.5 试剂盒
  •     2.1.6 引物及寡核苷酸链合成
  •     2.1.7 实验仪器及设备
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 PCR
  •     2.2.2 TA克隆
  •     2.2.3 酶切和连接
  •     2.2.4 大肠杆菌DH10B的感受态细胞制备及转化
  •     2.2.5 质粒提取
  •     2.2.6 全基因组提取
  •     2.2.7 pMT012质粒构建
  •     2.2.8 pMT019质粒构建
  •     2.2.9 ptracrRNA质粒的构建
  •   2.3 实验结果
  •     2.3.1 WCFS1全基因组的提取
  •     2.3.2 pMT012质粒的构建
  •     2.3.3 pMT019质粒的构建
  •     2.3.4 ptracrRNA质粒的构建
  •   2.4 讨论
  • 第三章 Cas9的表达优化研究
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 菌株与质粒
  •     3.1.2 引物
  •     3.1.3 培养基
  •     3.1.4 试剂
  •     3.1.5 试剂盒
  •     3.1.6 引物合成
  •     3.1.7 实验仪器及设备
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 PCR
  •     3.2.2 TA克隆
  •     3.2.3 酶切和连接
  •     3.2.4 质粒提取
  •     3.2.5 大肠杆菌DH10B的感受态细胞制备及转化
  •     3.2.6 植物乳杆菌WCFS1感受态细胞的制备与转化
  •     3.2.7 RNA的提取
  •     3.2.8 Real-time PCR （q-PCR）
  •     3.2.9 pMT021质粒的构建
  •     3.2.10 pMT023质粒的构建
  •     3.2.11 pMT026质粒的构建
  •   3.3 实验结果
  •     3.3.1 pMT021质粒的构建
  •     3.3.2 pMT023质粒的构建
  •     3.3.3 pMT026质粒的构建
  •     3.3.4 pMT012质粒q-PCR结果
  •     3.3.5 pMT019质粒qPCR结果
  •     3.3.6 Cas9和RecT蛋白表达量的优化结果
  •     3.3.7 感受态细胞制备优化结果
  •   3.4 讨论
  • 第四章 利用CRISPR-Cas9技术构建WCFS1敲除系统的验证
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 菌株与质粒
  •     4.1.2 引物
  •     4.1.3 培养基
  •     4.1.4 试剂
  •     4.1.5 引物及寡核苷酸链合成
  •     4.1.6 实验仪器及设备
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 PCR
  •     4.2.2 质粒和全基因组提取
  •     4.2.3 大肠杆菌DH10B的感受态细胞制备及转化
  •     4.2.4 植物乳杆菌WCFS1感受态细胞的制备与转化
  •     4.2.5 含pMT023质粒的感受态细胞WCFS1/023的制备与转化
  •     4.2.6 寡核苷酸链的设计
  •     4.2.7 影印平板法
  •     4.2.8 植物乳杆菌glmS1基因的敲除与筛选
  •   4.3 实验结果
  •     4.3.1 ptracrRNA质粒电转结果
  •     4.3.2 植物乳杆菌glmS1基因敲除的平板筛选结果
  •     4.3.3 glmS1基因敲除的验证
  •   4.4 讨论
  • 全文结论
  • 论文创新点
  • 展望
  • 参考文献
  • 在读期间发表的学术论文及研究成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 祁敏

    导师: 杨瑶

    关键词: 植物乳杆菌,基因敲除,乳酸菌

    来源: 南京师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,轻工业手工业

    单位: 南京师范大学

    分类号: TS201.3

    DOI: 10.27245/d.cnki.gnjsu.2019.001777

    总页数: 81

    文件大小: 5511K

    下载量: 179

    相关论文文献

    • [1].一株具降胆固醇功能的海洋源植物乳杆菌的筛选及其益生性能分析[J]. 现代食品科技 2020(02)
    • [2].植物乳杆菌对非酒精性脂肪肝小鼠的肝保护机制[J]. 基因组学与应用生物学 2020(04)
    • [3].植物乳杆菌生理特性及益生功能研究进展[J]. 食品与发酵工业 2019(01)
    • [4].植物乳杆菌发酵苹果汁及菌体活性保持[J]. 食品与发酵工业 2019(12)
    • [5].植物乳杆菌的研究进展[J]. 乳业科学与技术 2017(06)
    • [6].植物乳杆菌的功能性及工业化应用研究进展[J]. 中国乳品工业 2018(03)
    • [7].植物乳杆菌对羊奶发酵品质的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医 2018(17)
    • [8].植物乳杆菌素合成及其调控机制的研究进展[J]. 南京农业大学学报 2018(05)
    • [9].乳制品中选择性分离与计数植物乳杆菌的方法[J]. 食品与发酵工业 2018(09)
    • [10].泡菜中植物乳杆菌的分离鉴定[J]. 食品安全导刊 2017(Z2)
    • [11].德国苜蓿中植物乳杆菌包埋工艺及特性研究[J]. 食品工业 2016(11)
    • [12].植物乳杆菌发酵保藏三华李果坯工艺研究[J]. 轻工科技 2017(01)
    • [13].植物乳杆菌163产抗菌物质的发酵条件优化[J]. 食品工业科技 2017(06)
    • [14].魔芋甘露寡糖对植物乳杆菌和粪肠球菌共培养时发酵行为的影响[J]. 中国野生植物资源 2017(02)
    • [15].基于植物乳杆菌的发酵豆乳制品研究[J]. 食品工业 2017(07)
    • [16].胡萝卜片中富集植物乳杆菌的工艺优化[J]. 食品科学 2017(16)
    • [17].植物乳杆菌基因组研究进展[J]. 中国科技信息 2017(12)
    • [18].比较基因组学揭示植物乳杆菌ZJ316的生境适应性及潜在益生特性（英文）[J]. Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology) 2016(08)
    • [19].植物乳杆菌发酵培养物对肉鸡生长性能及血清生化指标的影响[J]. 中国畜牧杂志 2014(23)
    • [20].植物乳杆菌来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂的分离纯化[J]. 应用化工 2015(08)
    • [21].植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆及原核表达[J]. 湖北农业科学 2015(17)
    • [22].娃哈哈推七大新品 主打营养和健康[J]. 中国食品 2016(23)
    • [23].植物乳杆菌在水产养殖中的应用[J]. 科学养鱼 2013(12)
    • [24].植物乳杆菌在青梅汁中的生长及苹果酸乳酸发酵特性研究[J]. 现代食品科技 2013(12)
    • [25].不同生长因子对植物乳杆菌固体发酵的影响[J]. 当代化工 2020(01)
    • [26].不同植物乳杆菌发酵液抑菌活性及其主要有机酸组成比较（英文）[J]. 食品科学 2019(05)
    • [27].不同水平的植物乳杆菌代谢产物对肉鸡生长性能、粪微生物菌群及绒毛形态的影响[J]. 中国饲料 2019(04)
    • [28].植物乳杆菌在肉鸡生长中的应用研究进展[J]. 饲料博览 2019(05)
    • [29].新分离植物乳杆菌的药敏性和抑菌性试验[J]. 中国兽医科学 2019(07)
    • [30].一株植物乳杆菌的分离、鉴定及其特性研究[J]. 饲料研究 2019(09)

    标签：;  ;  ;  

    应用CRISPR/Cas9技术在植物乳杆菌中进行基因编辑的研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6