张鹏[1]2003年在《转染VEGF的BMSC复合冻干骨组织工程骨研究》文中认为由于肿瘤、炎症、外伤和发育异常等原因造成的骨缺损在临床上十分常见，所以，骨缺损是骨科医生经常面临的问题。骨缺损修复的过程中需要骨组织的新生，也需要组织的血管化，因此，血管化是骨缺损修复的一个重要因素。目前临床常用修复骨缺损的方法有自体骨移植、异体骨移植、基质材料替代，其中自体骨移植的骨来源有限，异体骨移植和基质材料替代缺乏种子细胞的支持。骨缺损修复的实验研究方法有：基质材料与种子细胞复合、基质材料与活性因子复合、基质材料与种子细胞加活性因子以及血管化复合组织工程骨的构建等，各试验都取得了一定的效果，但不十分理想。其中，基质材料尚无标准材料；活性因子，如骨形成蛋白等受多种因素影响；血管化复合组织工程骨程序过于复杂和昂贵。 目前，深冻骨已商品化，免疫排斥反应罕见发生，故本实验以冻干松质骨作为基质材料、转染有血管内皮细胞生长因子(VEGF)的骨髓基质干细胞为种子细胞，这样既保持了骨组织优良的空间结构，又提供了种子细胞和血管化的刺激因子。希望能为骨缺损及缺血性骨病治疗提供实验和理论依据。 1．真核表达载体pcDNA_3／hVEGF_(165)的构建 目的：构建一高效的真核表达载体，为下一步试验作准备。方法：将PT_7Blue／hVEGF_(165)质粒酶切获得hVEGF_(165)基因片段，构建pcDNA_3／hVEGF_(165)真核表达载体，鉴定，扩增并纯化。结果：获得hVEGF_(165)基因片段，并构建出pcDNA_3／hVEGF_(165)真核表达载体，经鉴定hVEGF_(165)基因片段的序列完全正确。结论：成功构建出pcDNA_3/hVEGF_(165)真核表达载体。 第四军医大学硕土学位论文 2．VEGF在兔BMSC内的表达及其对BMSC的影响目的：构建血管内皮细胞生长因子PCDNA3ANEGF165真核表达载体，并用脂质体法转染骨髓基质干细胞，观察血管内皮细胞生长因子转染后对骨髓基质干细胞的生长、转化的影响。方法：采用贴壁法分离骨髓基质干细胞，脂质体法转染。100眯胎牛血清 DMEM培养骨髓基质干细胞，计数法绘制生长曲线，特殊染色观察骨髓基质干细胞的转化，免疫组织化学法观察转染后血管内皮细胞生长因子的表达。结果：转染pCDNA3ffiVEGF16s的骨髓基质干细胞胞浆内出现血管内皮细胞生长因子阳性颗粒，而转染pCDNA。组及未转染组中未出现阳性颗粒，生长曲线在3组中无明显差别。特殊染色出现的时间亦无明显差别。而且，注射有转染pCDNA3栅GF；6的骨髓基质干细胞的兔局部血管数量增加，其它两组未发现血管数量增加。结论：转染pCDNA3／hVEGF165真核表达载体的兔骨髓基质干细胞，表达血管内皮细胞生长因子，其表达产物具有血管内皮增殖刺激活性。 3．转染 pcDNA3jhVEGF；。。的骨盼基质干细胞复合冻干骨体内成骨实验研究目的：将转染pCDNA3MEGF165骨髓基质干细胞复合冻干骨后，植入自体新西兰大白兔的肌袋内，观察其体内成骨的情况。方法：体外扩增兔骨髓基质干细胞，将pCDNA3几VEGF165质粒转染骨髓基质干细胞，然后将此细胞与同种异体冻干松质骨复合，将复合物植人兔竖脊肌肌袋中，以未转染的骨髓基质干细胞复合冻干松质骨和冻干松质骨作为对照。术后8周取材，通过大体和组织学观察体内骨形成的情况。结果：组织切片观察，转染VEGF的BMSC复合冻干骨组中，发现有大量纤维长入并有软骨和骨组织出现；冻干骨复合BMSC组发现有大量纤维长入并有成骨细胞和破骨细胞出现；而单纯冻干骨组仅出现大量纤维长入。结论：冻干骨复合转染有VEGF的BMSC具有很好的成骨活性。
田竞[2]2004年在《转基因骨髓基质干细胞复合冻干骨组织工程骨研究》文中研究说明由于肿瘤、炎症、外伤和发育异常等原因造成的骨缺损在临床上十分常见。骨缺损修复的过程中需要骨组织的新生，也需要组织的血管化，它是骨缺损修复的一个重要因素。目前临床常用修复骨缺损的方法有自体骨移植、异体骨移植、基质材料替代，其中自体骨移植的骨来源有限，异体骨移植和基质材料替代缺乏种子细胞支持。骨缺损修复的实验研究方法有：基质材料与种子细胞复合、基质材料与活性因子复合、基质材料与种子细胞加活性因子以及血管化复合组织工程骨的构建等，各实验都取得了一定的效果，但不十分理想。其中，基质材料尚无标准材料；活性因子，如骨形成蛋白等受多种因素的影响；血管化复合组织工程骨程序过于复杂和昂贵。 目前，深冻骨已商品化，免疫排斥反应罕见发生，故本实验以冻干松质骨作为基质材料、转染有血管内皮细胞生长因子(VEGF)的骨髓基质干细胞(BMSC)为种子细胞，这样既保持了骨组织优良的空间结构，又提供了种子细胞和血管化的刺激因子。希望能为骨缺损及缺血性骨病治疗提供实验和理论依据。 1、兔骨髓基质干细胞的体外培养 目的：在体外进行骨髓基质干细胞的培养和扩增，观察其形态学特点，为进一步研究基因转染对骨髓基质干细胞体外转化的影响和绘制生长曲线加以比较奠定工作基础。方法：贴壁法分离第四军医大学硕士学位论文兔骨髓基质干细胞，37℃，5%CO:培养箱培养，观察原代及传代细胞的生长发育情况，并绘制生长曲线;在矿化液中连续培养，观察其骨形成能力。结果:原代细胞培养第18d细胞融合成单层，长满整个培养皿;倒置显微镜下观察，矿化条件下，细胞培养30天，Von一Kassa染色显示有局灶状钙盐沉积。结论:骨髓基质干细胞易于分离培养，体外扩增速度快，在矿化条件下，骨髓基质干细胞在体外即具有很强的成骨能力，可以形成矿化结节，因而可以作为种子细胞，应用于骨组织工程。 2、逆转录病毒表达载体的构建 目的:构建高效的逆转录病毒表达载体，为下一步实验作准备。方法:将pT7Blue/hVEGF165质粒酶切获得hVEGF，65基因片段，构建peDNA3/hVEGF165并用pA317细胞包装，32oCG418培养48h。结果:获得hVEGF165基因片段并构建出peDNA3/hvEGF165逆转录病毒表达载体，经鉴定hVEGF165基因片段序列与GeneBank报道序列一致。结论:实验成功构建了pcDNA3/hVEGF165逆转录病毒表达载体。 3、vEGF在兔BMsc内的表达及其影响 目的:检测逆转录病毒介导血管内皮细胞生长因子 (hVEGFI“)基因转染兔骨髓基质干细胞(BMSC)后目的基因表达情况及促血管生成作用，为进一步将其用于血管化组织工程骨构建奠定基础。方法:构建含VEGF基因的逆转录病毒表达载体，通过感染兔BMSC使其获得稳定表达，使用免疫组化的方法检测其蛋白表达，并通过新生血管计数观察其促血管生成作用。结果:成功构建VEGF逆转录病毒表达载体，免疫组化方法显示经感染的BMSC胞质中有阳性棕色颗粒出现，且动物实验显示新生血管计数明显高于对照组(P<0.01)。结论:采用逆转录病毒介导的基因转移技术可将VEGF基因转染至BMSC中，可获得外源性蛋白的表达，且有明显的促血管生成作用。 4、转基因骨髓基质干细胞复合冻干骨体内成骨的实验研究第四军医大学硕士学位论文 目的:将转基因骨髓基质干细胞复合冻干骨后植入自体新西兰大白兔的肌袋内，观察其体内成骨的情况。方法:体外扩增兔骨髓基质干细胞，用含poDNA3/h vEGF165的病毒上清感染骨髓基质干细胞，然后将此细胞与同种异体冻干松质骨复合，将复合物植入兔竖脊肌肌袋中，以未转染的骨髓基质干细胞复合冻干松质骨和冻干松质骨作为对照。术后8周取材，通过大体和组织学观察体内骨形成的情况。结果:组织切片观察，转基因BMSC复合冻干骨组中，发现有大量纤维长入并有软骨和骨组织出现;未转基因的BMSC复合冻干骨组发现有大量纤维长入并有成骨细胞和破骨细胞出现;而单纯植入冻干骨组仅出现大量纤维长入。结论:冻干骨复合转基因骨髓基质干细胞具有良好的成骨活性。
参考文献：
[1]. 转染VEGF的BMSC复合冻干骨组织工程骨研究[D]. 张鹏. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[2]. 转基因骨髓基质干细胞复合冻干骨组织工程骨研究[D]. 田竞. 第四军医大学. 2004