朱德康[1]2003年在《五种血清型的鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白特性比较及其免疫原性的研究》文中指出本研究采用超速离心法提取了五种血清型的鸭疫里默氏杆菌(RA)外膜蛋白，采用SDS-PAGE技术对其电泳图谱进行比较分析，并采用免疫印迹技术对其免疫原性及是否存在交叉免疫原性进行了深入研究。 对五种血清型的鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白的SDS-PAGE图谱比较分析，结果表明其外膜蛋白的电泳图谱具有一定相似性。五种血清型的RA外膜蛋白存在7个分子量相同的条带，分子量分别为29KD、32KD、36KD、43KD、54KD、57KD和74KD。对主要外膜蛋白条带的组成进行分析后可将这五种血清型的鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白分为叁个外膜蛋白型，同时也表明不同血清型的菌株之间存在相同的外膜蛋白型。 使用抗RA外膜蛋白阳性鸭血清、抗RA阳性鸭血清和抗RA阳性鸡血清对RA外膜蛋白抗原进行免疫印迹检测，结果表明五种血清型的RA外膜蛋白均有免疫原性，且存在多种免疫原性的外膜蛋白成分；同时通过多份抗血清免疫印迹检测后的比较分析，证实7型的54KD外膜蛋白，8型的73KD外膜蛋白，21型的38KD外膜蛋白，20型的28KD外膜蛋白以及11型的28KD外膜蛋白是RA重要的免疫原性蛋白；将五种血清型的鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白经SDS-PAGE后同时转印到硝酸纤维素膜上，再分别与7型、8型、21型、20型和11型RA外膜蛋白免疫的阳性鸭血清进行抗原交叉识别反应，结果表明不同血清型菌株的外膜蛋白之间存在交叉免疫原性，74KD和31KD外膜蛋白是重要的交叉免疫原性蛋白。
朱德康, 程安春, 汪铭书[2]2004年在《五种血清型的鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白特性比较及其免疫原性的研究》文中进行了进一步梳理本研究采用超速离心法提取了五种血清型的鸭疫里默氏杆菌(RA)外膜蛋白,采用SDS-PAGE技术对其电泳图谱进行比较分析,并采用免疫印迹技术对其免疫原性及是否存在交叉免疫原性进行了初步研究。结果表明五种血清型的RA外膜蛋白的电泳图谱具有一定相似性且不同血清型的菌株之间存在相同的外膜蛋白型;使用不同的抗RA外膜蛋白阳性血清对RA外膜蛋白抗原进行免疫印迹检测,结果表明五种血清型的RA外膜蛋白均有免疫原性,且存在多种免疫原性的外膜蛋白成分;同时通过多份抗血清免疫印迹检测后进行比较分析,表明不同血清型菌株的外膜蛋白之间存在交叉免疫原性,74KD和31KD外膜蛋白是重要的交叉免疫原性蛋白。
朱德康[3]2006年在《鸭疫里默氏杆菌荚膜多糖输出蛋白基因的发现及其免疫原性研究》文中指出鸭疫里默氏杆菌病是家鸭、火鸡和多种其它鸟类的一种接触传染性疾病。该病呈世界范围分布，已在几乎所有的集约化养鸭生产的国家发现。该病的发病率和死亡率较高，已成为目前危害世界各国养鸭业最为严重的传染病之一，给养鸭业造成了巨大的经济损失。到目前为止，关于鸭疫里默氏杆菌的分子生物学研究资料较少，国内外尚无关于血清1型RA基因文库的研究报告。由于目前我国鸭疫里默氏杆菌病流行的血清型以1型出现频率最高，因此我们以血清1型RA菌株为材料构建基因文库，以期筛选出相应的抗原基因，为RA基因工程疫苗研究奠定基础，为该病的诊断与流行病学监测提供高纯度的特异性抗原。 本研究以血清1型RA CH-1株为材料，酚氯仿抽提基因组DNA。采用限制性内切酶Sau3A Ⅰ进行部分酶切消化，首先小量酶切优化确定酶切时间和作用浓度，然后在小量酶切预试验基础上扩大反应体系进行酶切，采用试剂盒纯化回收1.0kb-6.5kb片段，将其用T4 DNA连接酶与经BamH Ⅰ酶切并去磷酸化的ZAP Express载体进行连接，用噬菌体包装蛋白包装。经测定包装滴度为5.23×10~6pfu／ml，蓝白斑筛选重组率为96.8％，表明已成功构建血清1型RA基因文库。 在成功构建RA基因文库的基础上，采用兔血清对文库进行免疫筛选，获得了3个阳性斑，并对其中一个进行了复筛及纯化，对该阳性斑进行体内删除，对获得含插入片段的噬菌粒进行酶切鉴定正确后进行测序，并将该序列递交GenBank，获得登录号为DQ151838。 通过核酸序列相似性搜索比对、ORF分析、基因预测，初步判定ORF1110读框是一个完整的有意义ORF，是与荚膜多糖蛋白相关的基因；ORF1155读框则与外膜蛋白相关，但起始密码子上游未发现RBS(可能与起始密码子上游序列长度太短有关)，因此无法判断是否是一个真正的ORF；而ORF2141读框囿于序列长度只有起始密码子而没有终止密码子，因此并不是一个完整的ORF，有必要通过试验来补齐这段序列再进行分析；通过蛋白质序列搜索比对、亚细胞定位、跨膜区、疏水性预测分析，进一步证实ORF1110与荚膜多糖生物合成密切相关，而ORF1155则与包括外膜蛋白、表面抗原的多个蛋白家族相关；采用软件进行抗原性预测分析表明ORF1110
张克新[4]2004年在《血清2型鸭疫里默氏菌54KD外膜蛋白免疫原性研究》文中指出本研究经过超速离心法提取到血清2型鸭疫里默氏菌外膜蛋白后，对其进行SDS—PAGE凝胶电泳分析其蛋白条带，外膜蛋白条带分子量主要为17KD、32KD、50KD、54KD、74KD、91KD、98KD。 通过对所提的外膜蛋白做免疫印迹反应，发现54KD蛋白带阳性反应最明显，采用电洗脱法对粗提到的外膜蛋白进行SDS—PAGE电泳，然后切下含有54KD的凝胶带，再对其进行水平电泳，使外膜蛋白从凝胶中完全分离出来，经过多次收集后，将所得到的收集液进行SDS—PAGE电泳，证实所回收得到的蛋白为分子量54KD的外膜蛋白。将这些含54KD外膜蛋白回收液经蛋白含量测定后跟弗氏完全佐剂按1∶1体积比充分乳化，对8日龄雏鸭首免(蛋白量100μg／只)、首免后第14天进行二免(蛋白量100μg／只)。分别在首免前1天，首免后第7、14天，二免后第7、14、21、28天采血，用建立的间接ELISA方法测定各次所采血清的抗体水平，结果发现经过首免后第14天可测到有抗体产生；二免后第14天抗体水平最高，平均效价达到640，第28天时平均抗体效价仍达到320。通过本研究可以说明：用从RA2外膜蛋白中提取到的亚单位成分(分子量为54KD的外膜蛋白)免疫鸭可以产生较高的抗体水平，从而证实其具有较好的免疫原性，为今后研究、开发亚单位疫苗提供方向和依据。 本实验的第二部分是用RA1、RA2灭活菌加上油佐剂、蜂胶佐剂乳化后制成RA1油佐剂苗、RA2油佐剂苗、RA1+RA2二联油佐剂苗、RA1+RA2二联蜂胶苗四组全菌苗，分别用于免疫8日龄雏鸭，然后定期采血，用所建立的间接ELISA方法检测其抗体水平。然后对各组的抗体动态变化进行比较，发现油联苗的抗体效价比单价油苗的高，RA2菌的裂解上清液作包被抗原也能测到RA1油苗组的抗体，这可能是ELISA检测时对异型RA的抗体有交叉性的结果，在对RA1+RA2油联苗、RA1+RA2蜂胶联苗组的抗体动态做比较时，发现蜂胶联苗组产生抗体要比油联苗组的快，但油联苗组产生的抗体在高峰时明显比蜂胶联苗组的高。
参考文献：
[1]. 五种血清型的鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白特性比较及其免疫原性的研究[D]. 朱德康. 四川农业大学. 2003
[2]. 五种血清型的鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白特性比较及其免疫原性的研究[C]. 朱德康, 程安春, 汪铭书. 中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第叁届第七次学术研讨会论文集. 2004
[3]. 鸭疫里默氏杆菌荚膜多糖输出蛋白基因的发现及其免疫原性研究[D]. 朱德康. 四川农业大学. 2006
[4]. 血清2型鸭疫里默氏菌54KD外膜蛋白免疫原性研究[D]. 张克新. 中国农业大学. 2004