H9N2亚型禽流感病毒抗原变异的研究

论文摘要

H9N2亚型禽流感在世界范围内广泛流行,不但给养殖业造成惨重的损失,也对人类健康造成巨大的威胁。由于免疫压力和禽流感病毒自身容易变异的特点,导致H9N2亚型禽流感病毒经常发生抗原变异,最终造成免疫失败,因此对H9N2亚型禽流感病毒抗原变异的研究具有重要意义。研究发现2009年分离到的H9N2亚型禽流感病毒与之前的分离株相比抗原性发生了明显的变化,因此本研究选取了2009年的分离株A/chicken/Shanghai/441/2009（H9N2）（简称SH441）,构建HA的表达质粒pCAGGS-H9N1,免疫Balb/c小鼠,3次免疫后肌肉注射SH441全病毒,选择HI抗体效价最高的小鼠加强免疫,取脾细胞制备杂交瘤细胞,通过酶联免疫吸附实验（ELISA）和间接免疫荧光实验（IFA）筛选,获得20株能够稳定分泌抗H9亚型HA抗体的杂交瘤细胞株。HI实验发现有15株单抗具有HI活性,其中4E7和10G8的效价最高,可以达到210,而4B7的效价最低,为24。细胞微量中和实验发现,除3C8和8F11外的18株单抗具有中和活性,其中3F7中和效价最高,可以达到27。具有中和活性和血凝抑制活性的单抗并不完全一致,表明本研究获得了作用位点在血凝抑制氨基酸位点以外的中和相关氨基酸位点的单抗。Western blot实验发现,有14株单抗的作用位点是线性构象,有6株单抗的作用位点是空间构象。单抗亚类鉴定结果显示,20株单抗都是κ亚类,除8F11属于IgM外,其余19株单抗都属于IgG亚类。单抗作用区域检测结果显示20株单抗的作用位点都位于H9亚型HA1区域。为了探究近年来我国H9N2亚型禽流感病毒的抗原变异情况,本研究根据分离时间和地点选取了18株在1998-2015年间分离到的H9N2亚型禽流感病毒,分别与制备的单抗进行了HI和IFA检测,结果显示2009年以前的6株分离株与本研究获得的单抗的反应性较差,其中F株与所有单抗均没有HI活性,仅与12株单抗IFA呈现阳性且荧光较弱。HI和IFA发现9株相对广谱的单抗均可以与2009-2015年的分离株发生反应,而其余的单抗与不同的毒株反应表现出差异性。这些实验结果与之前报道的H9N2亚型禽流感抗原变异趋势一致,表明本研究获得的单抗可以用于H9N2亚型禽流感病毒抗原变异的研究。为了探究SH441与F株抗原差异的分子机制,SH441毒株与F株的HA1区域分段替换构建真核表达质粒,通过瞬时表达质粒和IFA发现,SH441毒株与F株抗原差异是HA基因第120-240氨基酸之间差异造成的。通过序列比对发现这一区域共有7个氨基酸不同,分别是第127、145、168、180、181、216和234位的氨基酸。运用反向遗传技术拯救F株与SH441毒株这7个位点的突变病毒,并将这些拯救病毒与制备的单抗进行了HI和IFA检测,结果表明HA基因第168位和234位氨基酸变异会造成SH441与F株的抗原差异。总之,本研究中筛选到20株抗H9亚型HA蛋白的单克隆抗体,并初步运用在H9N2亚型禽流感病毒的抗原变异的研究中,为H9N2亚型禽流感病毒抗原变异分析和抗原图谱的绘制提供材料。

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摘要

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英文缩略表

第一章引言

1.1 H9N2亚型禽流感概述

1.1.1 H9N2禽流感病毒

1.1.2 H9N2亚型禽流感的危害

1.1.3 H9N2亚型禽流感抗原变异

1.2 DNA免疫

1.2.1 DNA疫苗概述

1.2.2 提高DNA疫苗免疫效果的方法

1.3 单克隆抗体在抗原变异上的应用

1.3.1 单克隆抗体的研究进展

1.3.2 单克隆抗体在抗原变异方面的应用

1.4 本研究目的意义

第二章抗H9亚型禽流感病毒HA单抗的制备

2.1 实验材料

2.1.1 病毒、质粒、细胞及实验动物

2.1.2 主要仪器

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要试剂的配制

2.1.5 生物学软件

2.1.6 引物

2.2 实验方法

2.2.1 病毒扩增与纯化

2.2.2 质粒的中量提取

2.2.3 小鼠免疫

2.2.4 血凝抑制实验检测免疫效果

2.2.5 骨髓瘤细胞的准备

2.2.6 饲养层细胞的制备

2.2.7 脾细胞的制备

2.2.8 细胞融合

2.2.9 间接ELISA方法的建立

2.2.10 间接ELISA筛选杂交瘤细胞

2.2.11 间接免疫荧光实验筛选杂交瘤细胞

2.2.12 杂交瘤细胞的筛选与亚克隆

2.2.13 细胞冻存

2.2.14 单克隆抗体的检测

2.2.15 单克隆抗体亚类的鉴定

2.2.16 单抗作用区域的检测

2.3 实验结果

2.3.1 病毒纯化结果

2.3.2 动物免疫结果

2.3.3 建立间接ELISA检测的方法

2.3.4 杂交瘤细胞的克隆筛选

2.3.5 单抗ELISA检测结果

2.3.6 单抗IFA结果

2.3.7 单抗HI实验结果

2.3.8 单抗中和实验结果

2.3.9 Western Blot检测结果

2.3.10 单抗亚类鉴定结果

2.3.11 单抗作用区域鉴定结果

2.4 讨论

第三章抗H9亚型禽流感病毒HA单抗的在抗原变异中的初步应用

3.1 实验材料

3.1.1 病毒

3.1.2 主要仪器与试剂

3.2 实验方法

3.2.1 单抗对不同病毒HI的检测

3.2.2 单抗对不同病毒IFA的检测

3.3 实验结果

3.3.1 单抗与不同病毒HI实验结果

3.3.2 单抗与不同病毒IFA实验结果

3.4 讨论

第四章 SH441与F株抗原差异的分子基础研究

4.1 实验材料

4.1.1 主要仪器与试剂

4.1.2 质粒

4.1.3 引物

4.2 实验方法

4.2.1 SH441与F株HA基因嵌合重组质粒的构建

4.2.2 IFA检测

4.2.3 序列比对

4.2.4 SH441及F株重组病毒及点突变病毒的拯救

4.2.5 拯救病毒与单抗HI检测

4.2.6 拯救病毒与单抗IFA检测

4.3 实验结果

4.3.1 SH441与F株HA基因嵌合重组质粒构建结果

4.3.2 IFA检测结果

4.3.3 序列比对

4.3.4 病毒拯救

4.3.5 拯救病毒与单抗HI结果

4.3.6 拯救病毒与单抗IFA结果

4.4 讨论

第五章全文结论

参考文献

致谢

个人简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 屈孟锦

导师: 李泽君

关键词: 亚型禽流感病毒,单克隆抗体,抗原变异

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

分类号: S852.4

总页数: 66

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