张琪[1]2008年在《农杆菌介导的SAP1、GNA基因对白叁叶等草坪草的遗传转化研究》文中认为草坪是城市绿化的重要组成部分,其中双子叶草坪草,如白叁叶(Trifoliumrepens)、红叁叶(Trifolium pretense)、百脉根(Lotus corniculatus Linn)、马蹄金(Dichondra repens Forst.)等作为重要的观赏性草坪草在现代草坪建设中有着极为重要的应用价值,但是由于单一草种大面积种植、高水高肥的养护,使得草坪草极易受各种病虫害侵袭,其中病害包括白粉病、白绢病、萎蔫病等,虫害包括斜纹夜蛾、草地螟、叶蝉、蚜虫等。采用植物基因工程的方法可以对这些双子叶草坪草的抗性和品质进行改良。其中,农杆菌介导的转化方法是目前研究较透彻,较常规、较成熟的转化手段之一,具有操作简便、费用低廉、转化效率高等特点。本论文建立并优化了草坪草马蹄金、白叁叶和红叁叶的组织培养及植株再生体系,建立了农杆菌LBA4404介导的抗病基因SAP1基因和抗虫基因GNA基因对白叁叶的遗传转化体系,获得了白叁叶的转基因植株。主要研究结果如下:1.不同激素配比对马蹄金愈伤组织诱导影响不同。以马蹄金下胚轴、子叶和种子为外植体,愈伤组织诱导最佳激素浓度分别为:2,4-D 1mg/L+NAA0.5mg/L+KT 0.1mg/L、2,4-D 2mg/L+6-BA 0.1mg/L、2,4-D 0.5mg/L+NAA 0.1 mg/L;不同外植体产生的愈伤组织的质量不同,以马蹄金下胚轴和初生子叶为外植体诱导的愈伤组织较为致密,优于以种子为外植体产生的愈伤组织。但是马蹄金的愈伤组织分化和植株再生较为困难。2.以白叁叶吸胀子叶为外植体,在添加6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L的MS培养基上可分化出丛生芽,分化率为75.00%;丛生芽在原培养基上生根。以红叁叶子叶为外植体,在添加6-BA 1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+1mg/L KT的MS培养基上也可直接分化,分化率为73.75%,最佳生根培养基为MS+NAA 0.5 mg/L。3.选用白叁叶吸胀子叶为外植体,将携带SAP1基因的农杆菌菌液离心后,去上清,并用无激素1/2MS液体培养基悬浮使OD_(600)≈0.2,侵染白叁叶吸胀子叶35min;携带GNA基因的农杆菌菌液侵染外植体的最佳OD_(600)值约为0.3,侵染25min;共培养3天后,转入附加有45mg/L卡那霉素和400mg/L羧苄青霉素的再生培养基MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L上选择培养28d后,子叶柄再生出抗性芽,转化率分别达到26.32%和28.21%。抗性芽在附加有30mg/L的卡那霉素和400mg/L羧苄青霉素的生根培养基上继续筛选,长出抗性根,形成完整的转化植株。4.转化植株经PCR检测证明SAP1和GNA基因已经成功转入白叁叶基因组中。其中转SAP1基因的33株抗性植株中有28株为阳性,阳性率为84.84%;转GNA基因的31株抗性植株中有24为阳性,阳性率为77.42%。
许瑾[2]2006年在《几种草坪草的组织培养及遗传转化体系的建立》文中指出草坪草在人类生活中的地位越来越重要,以至已形成一项方兴未艾的产业——草坪业,筛选与培育优良的草坪草品种是草坪业的重要任务。由于传统育种手段的局限性,运用先进的分子生物学手段——植物遗传转化即转基因技术进行草坪草分子育种,培育理想的新品种,已成为草坪草育种研究的必然趋势。建立良好的受体材料再生体系是植物遗传转化研究的基础。本文以几种草坪草为材料在种子萌发的预处理、愈伤组织的诱导和植株再生、抗生素和中草药对农杆菌的抑制和对愈伤组织生长和分化的影响及黑麦草的遗传转化方面进行了探索,得到如下结果: 1.试验1中,对几种草坪草进行了多项预处理促进种子萌发的研究。从试验结果可以看出,大多数草种在实验室内常规萌发的发芽率并不高。采取一些预处理能够促进它们的萌发。在所试的几种预处理中,干湿交错、干35℃、磁场处理和低温处理对种子的促萌发效果最好,KNO_3处理效果也很好,磁处理的磁场强度以1000GS下发芽率最高,干湿交错中湿处理时间为16h萌发效果最佳。湿35℃、黑暗培养和H_2O_2处理在本试验中均对种子的发芽起抑制作用。 2.试验2中,对高羊茅、黑麦草、早熟禾和果园草这四种不同类型的草坪草进行了愈伤组织诱导、分化和植株再生的研究。各种材料愈伤组织诱愈率最高时所需的2,4—D浓度不同,这是由于它们基因型的差异造成的,但总体上诱导浓度明显高于一般禾本科的诱导浓度2mg/L。在叁种不同的基本培养基MS、NB和N_6中,对草坪草愈伤组织诱导和培养最佳的是N_6培养基。在添加了500mg/L脯氨酸、300mg/L水解酪蛋白和100mg/L的继代培养基中生长的愈伤组织的生理状态好于无添加物的培养基上生长的愈伤组织,其愈伤组织增殖较快、组织致密、色泽淡黄。叁种细胞分裂素对草坪草愈伤组织分化的影响随植物材料和品种而异。 3.试验3中,比较了六种抗生素(头孢拉定、头孢曲松钠、头孢唑啉钠、氨苄青霉素、羧苄青霉素和青霉素钠)对农杆菌的抑菌效果和对高羊茅和黑麦草愈伤组织生长和分化的影响。试验结果显示,抑菌效果最好的是头孢曲松钠,其次是羧苄青霉素和头孢唑啉钠;不同抗生素对叁种愈
王培佳[3]2008年在《匍匐翦股颖、沟叶结缕草离体培养与遗传转化初步研究》文中研究说明匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera L.)是多年生匍匐茎型草本植物,可形成细致、平整均一,致密如绿色地毯的草坪坪面,是高尔夫球场的首选草种。沟叶结缕草(Zoysia matrella(L.)Merr.),又称马尼拉草,是我国南方大部分地区草坪的主要栽培种。筛选与培育优良的草坪草品种是草坪业的重要任务。本论文主要分成以下叁部分:第一部分以匍匐翦股颖L-93的种子为外植体,系统比较了不同蔗糖浓度、不同生长调节剂的组合和浓度、暗培养,以及不同添加物对愈伤组织诱导的影响。第二部分以匍匐翦股颖细叶突变体的匍匐茎为外植体,系统比较了不同生长调节剂的组合和浓度,不同蔗糖浓度,不同固化物以及外植体不同位置的茎节对愈伤组织诱导的影响。第叁部分以匍匐翦股颖、沟叶结缕草的愈伤组织,匍匐翦股颖细叶突变体、沟叶结缕草的匍匐茎为材料,初步进行了农杆菌(dgrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化。主要研究结果如下:1.在试验1中,随着蔗糖浓度的升高,愈伤组织的诱导率是先升高,后降低。以蔗糖浓度为40g/L时,愈伤组织的诱导率最高。在9种不同的生长调节剂配比中,2 mg/L 2,4-D和0.1 mg/L 6-BA的配比对匍匐翦股颖种子诱导愈伤组织的效果是最佳。试验还发现暗培养、在培养基中添加椰乳和脯氨酸对愈伤组织的增殖有明显的促进作用。2.在试验2中,发现2 mg/L 2,4-D和0.1 mg/L 6-BA的生长调节剂组合中匍匐茎愈伤组织诱导率最高。生长素与细胞分裂素的浓度之比也影响着愈伤组织的诱导,以2 mg/L 2,4-D和0.1 mg/L 6-BA组合的培养基愈伤组织诱导率最高。在试验设计的6种蔗糖浓度中,40g/L是匍匐茎诱导愈伤组织最有效的蔗糖浓度。在4种固化物的比较中,愈伤组织诱导率最高的是Phytagel。在茎节的不同位置中,离顶端最近的茎节愈伤组织诱导率最高。3.在试验3中,通过对匍匐翦股颖和沟叶结缕草的愈伤组织的筛选,当草甘膦浓度为1.0mM时,匍匐翦股颖和沟叶结缕草的再生率分别为15.5%和4.5%;当草甘膦浓度为2.0mM时,匍匐翦股颖和沟叶结缕草的再生率分别为8.75%和1.78%。通过对匍匐翦股颖和沟叶结缕草的匍匐茎的筛选,仅在草甘膦浓度为1.0mM时,匍匐翦股颖细叶突变体有一株再生,再生率为1.2%。
姜茜[4]2008年在《农杆菌介导的GNA基因对禾本科草坪草的遗传转化研究》文中提出狗牙根[Cynodon dactylon(L.)Pars.]、结缕草(Zoysia japonica Steud.)和高羊茅(Festuca arundinacea)是国内外广泛应用的重要禾本科草坪草。由于草坪种植方式和养护方法的局限性,使草坪草容易受到害虫的侵袭,而且虫害蔓延速度较快。因此,利用植物基因工程技术改良其抗虫性,对防治害虫的危害,减少杀虫剂的使用,保护环境,节约草坪维护费用具有重要的意义。农杆菌介导法是植物基因工程中的常用方法,具有操作简便、转化率高、费用低廉的特点。本论文对狗牙根、结缕草和高羊茅的组织培养与植株再生技术进行了研究,对于农杆菌介导的抗虫基因——雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)基因对这3种禾本科草坪草的遗传转化技术进行了探索。经PCR方法检测,已获得转基因的阳性植株。其主要研究结果如下:1.以狗牙根、结缕草、高羊茅种子为外植体进行愈伤组织诱导,狗牙根和结缕草最佳愈伤组织诱导培养基为N6培养基,分别添加2mg/L和4mg/L 2,4-D时愈伤组织诱导率最高,为74.67%和86.67%;MS培养基较适合高羊茅的组织培养,当2,4-D浓度为11mg/L时,愈伤组织诱导率最高,为73.33%。2.狗牙根愈伤组织在1/2 MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.5mg/L培养基上可分化,分化率为28.13%,分化芽在1/2 MS培养基上即可生根;结缕草愈伤组织分化培养基为1/2 N6+0.1 mg/L 2,4-D,分化率为46.88%,生根培养基为MS+NAA0.5mg/L+KT 0.5mg/L;高羊茅愈伤组织分化培养基为MS+1 mg/L 2,4-D+6-BA2mg/L,分化率为77.78%,生根培养基为原分化培养基。3.添加一定浓度的壳聚糖(Chitosan)对狗牙根和结缕草愈伤组织诱导和分化均有一定程度的促进作用。当添加一定浓度的壳聚糖时,狗牙根和结缕草的愈伤组织诱导率均能够显着提高,狗牙根愈伤组织诱导率最高提高至86.67%,结缕草愈伤组织诱导率最高提高至98.33%;狗牙根和结缕草愈伤组织分化率分别提高至35.00%和78.13%。4.狗牙根遗传转化体系中,用于侵染愈伤组织的农杆菌菌液最佳OD_(600)值约为0.4,侵染时间为30min;结缕草遗传转化的最佳条件和狗牙根相同;侵染高羊茅愈伤组织的农杆菌菌液最佳OD_(600)值约为0.5,侵染时间为20min。共培养3d后,转入附加抗生素的再生培养基上进行选择培养,愈伤组织分化出抗性芽。抗性芽在附加有抗生素的生根培养基上继续筛选,长出抗性根,形成完整的转化植株。狗牙根、结缕草和高羊茅的转化率分别为25.64%、38.46%和52.63%。随机抽取转化植株进行PCR检测,阳性率均在70%以上。
余斌[5]2009年在《多年生黑麦草离体再生体系及农杆菌介导的高效遗传转化体系的建立》文中提出多年生黑麦草(Lolium perenne L. ) (perenial ryegrass)是一种优良的牧草和草坪草,其栽培品种繁多,广泛种植于世界各地。但由于自交不亲和,而导致利用传统方法对其进行遗传改良困难而复杂。生物技术尤其是转基因技术能够有效解决这一难题,并快速改善不良的靶基因性状。过去,针对于单子叶植物的遗传转化,主要采用基因枪法;随着转基因技术的日臻完善,农杆菌介导的遗传转化方法越来越多的被应用于单子叶植物之中。本实验在研究黑麦草离体培养基础之上,着重对农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的多年生黑麦草高效遗传转化体系进行了研究,实验获得如下结果:(1)以6种多年生黑麦草夜影、畅通、绿宝石、顶峰、Nu Speed、A8393的成熟胚和生长点为外植体,在含有6种不同2,4-D浓度的MS培养基中诱导愈伤组织,发现5.0 mg/L2,4-D诱导两种外植体形成愈伤组织及胚性愈伤组织的效果最好,其中成熟胚的愈伤组织及胚性愈伤组织平均频率最高为50%和35%;生长点愈伤组织及胚性愈伤组织平均频率最高为60%和45%。(2)不同黑麦草愈伤组织的分化频率不同,以夜影的分化频率最高,可达98%。另外,加有一定6-BA浓度的MS培养基有助于胚性愈伤组织的分化,当6-BA浓度为1.0 mg/L时愈伤组织的分化率最高,为87.5%。(3)以继代14d左右的胚性愈伤组织为材料进行农杆菌介导的遗传转化,发现当农杆菌工程菌液浓度OD650为0.8时,GUS阳性发生率最高(57.3%);添加200 mmol/L乙酰丁香酮,侵染20min、共培养3d的抗性愈伤组织频率最高,为56%。(4)使用不同浓度的两种脱菌剂—羧苄青霉素和Timentin对共培养愈伤组织进行脱菌处理,发现timentin在200mg/L浓度下抑菌效果达到100%,而羧苄青霉素至少应在250mg/L的浓度下才能有效脱菌。(5)不同浓度的潮霉素对转化的愈伤组织交替筛选有助于获得转基因植株;以80 mg/L潮霉素筛选两周,50 mg/L潮霉素筛选两周,25 mg/L潮霉素筛选两周的效果最好。潮霉素筛选后将愈伤组织转入分化培养基且光照处理,30d后将获得转化植株。(6)本实验共获得28个抗性转化植株,对其中夜影的11个抗性转化植株进行GUS染色,有8个植株呈现阳性反应,进一步的PCR检测证明,获得了4个含有Pcambia1305.1质粒的转基因植株。
陈彦龙[6]2007年在《农杆菌介导的多年生黑麦草的遗传转化》文中认为草坪草在人类生活中的作用日益突出,对其进行品种培育和改良也成为当今世界的一项重要工作。由于传统育种手段有很大的局限性,利用基因工程培育和改良草坪草品种是一种便捷和实用的途径,也是草坪草育种研究的必然趋势。多年生黑麦草是国内外广泛应用的重要冷季型草坪草之一,利用植物基因工程技术改良其除草剂抗性及抗虫性,不仅可以减少化学除草剂及化学杀虫剂的使用,保护环境,节约草坪维护费用,而且对于保持草坪的观赏性也有重要作用。目前,黑麦草的遗传转化方法主要有基因枪法、硅碳纤维法、原生质体直接转化法及农杆菌介导法。本实验对黑麦草的组织培养和植株再生进行了研究,通过农杆菌介导的方法进行黑麦草的遗传转化,已获得转抗除草剂基因的多年生黑麦草植株和转抗虫基因的多年生黑麦草植株。主要研究内容如下:(1)以多年生黑麦草Dt808011的成熟胚为外植体,在MS培养基中附加5mg/L 2,4-D,诱导胚性愈伤组织效果较好,胚性愈伤组织的诱导率可达15.1%。在分化培养基中添加一定浓度的6-BA,有助于愈伤组织的分化,6-BA浓度为1 mg/L时愈伤组织的分化率较高,建立了高效的黑麦草成熟胚再生体系。(2)研究了农杆菌浸染黑麦草的遗传转化效率的影响因素,优化了转化条件:以继代5-10天的胚性愈伤组织为受体,农杆菌浸染液浓度OD660=1.0,添加100mg/L的乙酰丁香酮,在0.5×105Pa负压下真空处理5min,浸染时间控制在30min以内。gus基因瞬间表达分析表明,此条件下获得的阳性愈伤组织比例较高,可达54.32%。(3)转基因植株的获得。构建表达载体p3301-Ubi8c,p3301-Ubi8e和p3301-Ubi8g。分别将pDM805(含抗除草剂bar基因)和上述3个抗虫基因(cry8C、cry8E和cry8G)的质粒载体,导入根癌农杆菌AGL1。通过农杆菌介导法转化黑麦草愈伤组织,得到转基因植株,经过PCR、GUS组织染色及Basta抗性实验检测,117株转基因植株中有61株为含bar基因的阳性植株,转基因植株阳性率约为52.1%;3个抗虫基因的部分转化植株经PCR检测,也得到了含有外源基因的阳性株系。
刘文真[7]2003年在《农杆菌介导的草坪草遗传转化研究》文中认为本实验以高羊茅和多年生黑麦草成熟种子为材料，研究了影响其植株再生的若干因素，建立了农杆菌介导的遗传转化体系。获得的主要研究结果如下： 1 不同生长激素种类和浓度的诱导培养基，对多年生黑麦草和高羊茅的组织培养产生不同影响，结果发现，dicamba作为生长激素的效果要好于2，4-D；以2，4-D为生长激素时，在9 mg l~(-l)的浓度范围内，随着2，4-D浓度的增加，植株再生率呈上升的趋势：在5 mg l~(-1)dicamba和5 mg l~(-1)2，4-D的处理中加入1 mg l~(-1) NAA对植株再生率的影响不大。 2 低浓度的6-BA(0.1mg l~(-1))可以提高高羊茅的植株再生率，而高浓度的6-BA显着抑制愈伤组织的产生，而使高羊茅植株的再生率降低。 3 在诱导培养基中加入2mg l~(-1)ABA显着抑制芽的生长和愈伤组织的产生，对高羊茅的植株再生产生负面影响。 4 比较了叁种基本培养基有机营养成分对高羊茅组织培养的影响，结果发现，B5有机营养成分效果最佳，M8有机营养成分次之，而MS有机营养成分效果最差。 5 低浓度的脯氨酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白(100 mg l~(-1))有利于提高高羊茅的植株再生率，而高浓度则起反作用。 6 在多年生黑麦草的组织培养中发现，蔗糖代替麦芽糖作为碳源，有利于提高多年生黑麦草的植株再生率。 7 在遗传转化中发现，在分化培养基中加入50 mg l~(-1)的潮霉素，可以提高对转化细胞的筛选效率。 8 建立了多年生黑麦草和高羊茅的遗传转化体系，通过这套体系获得了46株多年生黑麦草和7株高羊茅的再生植株，其中6株多年生黑麦草和1株高羊茅为PCR阳性。
李雪[8]2008年在《多年生黑麦草基因转化与抗旱性遗传改良研究》文中进行了进一步梳理本研究通过建立多年生黑麦草(Lolium perenne L.)高频再生体系,应用基因枪和农杆菌介导法将DREB1A和BADH-CMO基因导入胚性愈伤组织,获得正常生长的抗性增强的可育转基因植株;通过人工授粉和自由杂交方式获得转基因子代,并研究了其萌发、盆栽和田间生长特性;建立了快速检测多年生黑麦草转基因植株潮霉素(hyg)抗性的方法和抗旱子代筛选体系;综合评价了转基因多年生黑麦草的安全性。通过5年多的研究,在以下几个方面取得了进展:1、选择适宜品种,以胚为外植体,建立多年生黑麦草高频再生体系,使愈伤诱导率达到97.9%,胚性愈伤率达到19.4%,分化率可达90.9%。2、建立起多年生黑麦草遗传转化筛选系统:愈伤培养阶段添加hyg 100mg/L,筛选30d;植株再生阶段50mg/L,筛选至有芽长出后移入不含hyg的生根培养基中。农杆菌介导转化时以头孢霉素(cef)为抑菌剂,愈伤培养阶段添加300mg/L,植株再生阶段250mg/L。3、建立多年生黑麦草基因枪遗传转化体系:以0.5～1mm间的胚性愈伤组织为受体,金粉直径1μm,采用Ca(NO3)2+PEG4000作为DNA沉淀剂,6cm高度下轰击2次。获得转DREB1A基因爱神特转基因株系(ATR)68个,特拉华转基因株系(DTR)7个,尤文图斯转基因株系(JTR)18个;转BADH-CMO基因爱神特转基因株系(ABC)15个,叁个品种的平均抗性绿苗率为11.1%。4、建立多年生黑麦草农杆菌介导遗传转化体系:以预培养5d的胚性愈伤组织为受体,采用OD600=0.1左右的农杆菌菌液侵染10min,期间进行抽真空和晃动处理。去除菌液后,共培养4d,以500mg/L cef清洗后筛选,获得转DREB1A基因爱神特转基因株系(AGR)14个。5、转基因多年生黑麦草在温室和田间均可正常生长,盆栽ATR、AGR和ABC较ACK生长速度减慢,田间ATR、AGR、JTR、DTR与对照植株无明显差异,但ABC的生长受到严重抑制。外源基因的插入不仅使转基因植株的抽穗时间提前,还导致其穗长变短,尤其是BADH-CMO基因显着降低了ABC的穗长。DREB1A基因使转基因植株的抽穗个数略有提高,而BADH-CMO基因则使其显着降低。转基因植株较对照植株具有更高的抗旱、越冬和耐盐性,但抵御病害的能力明显下降,在对抗虫害方面二者无明显差异。除ABC外,转基因植株均能结实。6、采用人工授粉和隔离杂交两种方式获得大量转基因子代,T1代种子具有较高的发芽势和发芽率。以JTR为父母本的种子的发芽势具明显优势,以AGR为母本的种子的平均发芽势最低,以DTR为父本的种子的平均发芽势最低。T1代7天的平均芽长和根长分别为3.9cm和3.2cm。以JTR为父母本的种子,平均芽长最长,而以AGR为父母本种子,平均芽长最短。田间JTR的子代表现最优,以DCK和ATR-12为母本自由杂交的子代出苗势和出苗率均达100%。自由杂交授粉比人工授粉的种子具有更高的田间出苗势、出苗率、苗高和分蘖数,即使同一母本所得种子的萌发能力也不同。7、hyg和PEG对爱神特种子的萌发具有极显着影响,75mg/L hyg将发芽势降至44.8%,但发芽率仍达61.5%,hyg不适合在萌发期筛选转基因子代。15%的PEG只能使极个别种子发芽,20%则完全不能发芽。以15%的PEG筛选转基因T1代种子,推测的外源基因分离规律均低于孟德尔遗传定律。8、建立快速检测多年生黑麦草转基因植株hyg抗性的方法:1mg/L 6-BA+50mg/L hyg可用于多年生黑麦草离体叶片段的筛选,第8天时的褐化情况可作为初步筛选转基因植株的依据。盆栽T1代经干旱筛选后恢复生长的植株进行hyg叶片筛选,经筛选后的植株进行PCR检测全部呈阳性,初步说明外源基因在植物体内能够稳定遗传。9、转DREB1A和转BADH-CMO基因多年生黑麦草属于安全等级为I级的转基因植物,已经国家林业局生物安全处批准进行中间试验。
张磊[9]2005年在《几种草坪草转基因及体细胞无性系变异的研究》文中认为本试验以成熟种子为试材,优化了日本结缕草愈伤组织诱导及分化再生及农杆菌介导遗传转化的关键因子,在此基础上进行了 bt 基因转化日本结缕草的研究;在建立了高羊茅高效再生体系的基础上,将体细胞无性系变异技术与诱变技术相结合进行了高羊茅优质突变体的研究。结果如下:1)以破除休眠的日本结缕草和高羊茅成熟种子为外植体,通过单因素和多因素试验确定了两种草坪草愈伤组织诱导、继代和分化的最佳培养基。结果表明,日本结缕草愈伤组织的诱导培养基为含 2,4-D 1 mg/L+NAA 3mg/L 的 MS 培养基;继代培养基为含2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L 的 MS 培养基;分化培养基为含 6-BA 3 mg/L+KT 3.5mg/L 的 MS 培养基;生根培养基为含 NAA 0.3mg/L 的 MS 培养基。高羊茅愈伤组织的诱导培养基为含 2,4-D 5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L 的 MS 培养基;分化培养基为含 6-BA 3mg/L 的 MS 培养基;生根培养基为不含激素的 1/2MS 培养基。以上所有固体培养基中均添加 30g/L 的蔗糖和 3g/L 的 phytagel。 2)将获得的胚性愈伤组织进行γ辐照处理,经再生后获得了一批日本结缕草和高羊茅的叶形、叶色、株高等突变体。对其中的黄叶高羊茅种子后代进行空间技术处理。结果表明,空间技术引起的 SP1生理损伤较轻,SP2未发现叶绿体缺失突变,但株叶形态、熟期和耐热性变异丰富,从中筛选、鉴定了半矮秆、匍匐性、细叶、迟熟、耐热性等优质抗逆黄叶高羊茅突变体。 3)以 gus 基因瞬时表达为指标,对农杆菌介导日本结缕草成熟种子诱导的愈伤组织转化体系及其影响因子进行了系统性研究。结果表明,获得最佳转化效率的条件为:取继代培养 2 周的胚性愈伤组织于添加 100μmol/L AS 的培养基上预培养 3-5d;感染前24h 进行 2Gy 辐照处理,再接种于预培养基上; OD600 值为 0.2 的菌液感染 5min,于注射器中抽拉 20 次;感染后于光照或 16h 光照、22℃条件下共培养 3d;选择培养间隔以 7-10d 为宜。研究了不同抗生素的抑菌效果和日本结缕草愈伤组织的本底耐受性。结果表明,250-500mg/L 的羧苄青霉素可以较好地抑制农杆菌的生长。日本结缕草对潮霉素比卡那霉素更敏感,将愈伤组织接种于含潮霉素 200mg/L 的诱导培养基上,两周后愈伤组织褐化死亡率超过 90%。
吴琼[10]2007年在《农杆菌介导rd29A启动子驱动AVP1基因转化匍匐翦股颖的研究》文中研究指明随着我国草坪业的快速发展，草坪草遗传育种工作越来越受到人们关注，生物技术在草坪草品种改良中具有很大的应用潜力。干旱和高盐是限制草坪草生长的主要环境因子，当前我国特别缺乏抗旱耐盐的草坪草品种。利用植物基因工程技术，克隆并转化抗旱耐盐基因，使其在草坪草中表达，可以明显加快耐盐抗旱新品种的选育，具有广阔的应用前景。拟南芥液泡质子焦磷酸酶Arabidopsis Vacuolar H~+-Pyrophosphatase(AVP1)通过调节液泡膜两侧的质子梯度，控制植物生长激素的运输，随之影响依赖生长素的各种发育事件，使植物在高盐和干旱胁迫下产生适应性。拟南芥rd29A(Responsive to Dehydration，rd29A)启动子是胁迫诱导型启动子，能在干旱、低温和高盐条件驱动下游基因表达。本文运用农杆菌介导法将从拟南芥中克隆的AVP1基因转入匍匐翦股颖，在诱导型的rd29A启动子驱动下进行表达，并对获得的转基因匍匐翦股颖进行抗旱耐盐生理测定，获得了抗旱耐盐性增强的草坪草。主要实验结果如下：1、建立了草坪草的愈伤组织遗传转化受体系统。以冷季型草坪草匍匐翦股颖和高羊茅的种子作为外植体，愈伤组织诱导率分别为53.0±8.7％和60.7±7.9％，均能诱导产生胚性愈伤组织，胚性愈伤组织生长稳定，继代一个月后生长速率可达206.0±43.7％和159.3±34.4％。而暖季型草坪草狗牙根以种子作为外植体的愈伤组织诱导率仅为14.7±4.0％，且只产生非胚性愈伤组织，该愈伤组织生长速率为78.4±23.2％；以狗牙根的节作为外植体可以诱导出胚性愈伤组织，但数次继代后转为非胚性愈伤组织。2、通过农杆菌介导法将rd29A启动子驱动AVP1基因的pCambia1302表达载体转入匍匐翦股颖。分别用浓度为50、75、100mg/L潮霉素筛选转化愈伤组织，叁种浓度的筛选率为64.1±5.0％、81.5±1.5％和33.3±3.8％。经过一个半月的筛选，50mg/L潮霉素筛选后的转化愈伤的hpt-PCR阳性植株比率仅为0.9％，75mg/L浓度下的分化植株hpt-PCR阳性比率高达96.7％。因此，确定75mg/L为匍匐翦股颖转化愈伤的最佳筛选浓度。3、转基因匍匐翦股颖植株的PCR鉴定。获得再生匍匐翦股颖植株90株，其中hpt-PCR阳性株87株，阳性比率为96.7％；AVP1-PCR阳性株13株，阳性比率为14/4％。4、转基因匍匐翦股颖愈伤组织中AVP1基因表达的RT—PCR检测。结果显示，在正常培养条件下转基因愈伤AVP1基因微量表达，而在干旱(干燥48h)、低温(4℃，24h)或高盐(200mM NaCl)胁迫下AVP1基因的表达均明显增强；未转基因的野生型材料中，无论处理与否均未检测到AVP1基因的表达。该结果表明在非胁迫条件下rd29A启动子的活性很低，而在干旱、低温或高盐处理条件下活性明显增强，从而启动其下游基因AVP1的表达。由此验证了干旱、低温和高盐条件能促进转基因匍匐翦股颖中目的基因AVP1的表达水平。5、转基因匍匐翦股颖愈伤组织的抗性生理分析。经干燥处理2天和3天后，转基因愈伤组织的恢复生长速率为645％和543％，野生型的为423％和135％，可见转基因匍匐翦股颖比野生型具有更强的耐旱性；在高盐胁迫下，用0-200 mM不同浓度NaCl处理的转基因愈伤，其生长速率均高于相同情况下的野生型愈伤。尤其是在NaCl浓度分别为50mmol/L，200mmol/L时两者的差异较大，分别相差170％和148％。表明转AVP1基因的匍匐翦股颖的高盐耐受性增强。6、转基因匍匐翦股颖植株的抗性生理分析。经过9天的干旱胁迫后，转基因翦股颖小苗叶片为鲜绿色，而野生型草叶片则明显萎焉变黄。对干旱处理前后小苗相对含水量进行测定，干旱处理前转基因和野生型翦股颖小苗的含水量差异不明显，而干旱胁迫后转基因翦股颖的含水量为82.6％，明显高于野生型的77.5％，说明转基因匍匐翦股颖比野生型耐旱。转基因植株根的生物量测定结果显示，转基因植株根的干重平均为0.17±0.02g，而野生型植株平均只有0.07±0.01g，两者差异明显。此结果表明转基因植株具有发达的根系，有利于植物吸取土壤中的水份和养分，增强对干旱的耐受性。
参考文献：
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[7]. 农杆菌介导的草坪草遗传转化研究[D]. 刘文真. 浙江大学. 2003
[8]. 多年生黑麦草基因转化与抗旱性遗传改良研究[D]. 李雪. 北京林业大学. 2008
[9]. 几种草坪草转基因及体细胞无性系变异的研究[D]. 张磊. 安徽农业大学. 2005
[10]. 农杆菌介导rd29A启动子驱动AVP1基因转化匍匐翦股颖的研究[D]. 吴琼. 浙江大学. 2007
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