EHV-1多克隆抗体的制备及其皮层蛋白UL16的原核表达

论文摘要

马鼻肺炎（Equine rhinopneumonitis,ER）是由马疱疹病毒 Ⅰ 型（Equine herpes virus type 1,EHV-1）和马疱疹病毒 Ⅳ 型（Equine herpesvirus type 4,EHV-4）引起的主要感染马属动物的高度接触性传染病。该病不仅可以表现不同程度的呼吸道症状,EHV-1还可以导致流产和致死的马脊髓性脑炎,给养马业带来严重的威胁。UL16蛋白为EHV-1的皮层蛋白之一,由ORF46编码,基因高度保守,在病毒复制和成熟过程中起重要作用。本实验的目的是制备EHV-1兔多克隆抗体,并通过原核表达系统获取体外表达的UL16蛋白。利用蔗糖梯度离心法将EHV-1 438/77株进行纯化,将纯化的病毒蛋白与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂进行乳化,分别对家兔进行首次免疫和加强免疫制备免疫血清;通过Westerm Blot检测显示,制备的EHV-1兔免疫血清中的多抗与EHV-1全病毒蛋白结合反应性良好。根据在GenBank上发表的ORF46基因的序列设计特异性引物,在引物末端引入EcoRI和XhoI两个酶切位点,通过PCR来扩增目的片段。纯化的PCR产物克隆到表达载体pET-32a,构建重组原核表达质粒pET-32a-UL16,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态,鉴定阳性的重组菌分别以16℃和37℃、1mM的IPTG进行过夜诱导表达。SDS-PAGE结果显示,在59KD处出现与预期蛋白大小一致的条带。Western Blot鉴定结果显示,原核表达蛋白UL16可以与我们制备的EHV-1兔多克隆抗体有效的结合。本研究成功制备了抗原结合性良好的EHV-1兔多克隆抗体,并成功获得了具有良好反应原性的原核表达蛋白UL16。为EHV-1的UL16蛋白功能研究及新的诊断方法的建立提供研究基础。

论文目录

摘要

Abstract

缩略语表

1 引言

1.1 马鼻肺炎概述

1.2 马疱疹病毒的分型及其生物学特性

1.2.1 马疱疹病毒的分型

1.2.2 病毒的形态结构

1.2.3 病毒的基因组结构

1.2.4 病毒的理化性质

1.2.5 主要蛋白功能

1.2.6 致病机制

1.2.7 潜伏感染

1.3 临床症状

1.4 流行病学

1.5 临床诊断

1.6 实验室诊断

1.6.1 组织学诊断

1.6.2 病毒的分离鉴定

1.6.3 聚合酶链式反应

1.6.4 血清中和实验

1.6.5 酶联免疫吸附实验

1.6.6 直接免疫荧光

1.7 马鼻肺炎的防控措施

1.8 疫苗的研究进展

1.9 本实验的目的和意义

2 试验一 EHV-1全病毒兔的多克隆抗体的制备

2.1 材料

2.1.1 细胞、毒株、及实验动物

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器和耗材

2.2 方法

2.2.1 病毒感染滴度的测定

2.2.2 细胞的培养和病毒的增殖

2.2.3 病毒的浓缩和纯化

2.2.4 病毒蛋白的乳化

2.2.5 动物免疫及免疫血清的制备

2.2.6 多抗的Western Blot鉴定

2.3 结果与分析

2.3.1 病毒感染滴度的测定结果

2.3.2 病毒最适接毒量计算结果

2.3.3 病毒超速离心结果

2.3.4 兔多抗的Wetern Blot鉴定

3 试验二 EHV-1 UL16蛋白原核表达

3.1 材料

3.1.1 菌株、质粒、毒株及抗体

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器和耗材

3.2 方法

3.2.1 引物设计

3.2.2 UL16基因的获取

3.2.3 重组克隆质粒的构建及鉴定

3.2.4 重组表达质粒的构建及鉴定

3.2.5 重组表达质粒的诱导表达

3.2.6 重组UL16蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析

3.2.7 重组UL16蛋白表达的Western Blot鉴定

3.3 结果与分析

3.3.1 PCR反应结果

3.3.2 重组克隆质粒双酶切鉴定结果

3.3.3 重组表达质粒双酶切鉴定结果

3.3.4 重组表达质粒测序及比对结果

3.3.5 SDS-PAGE分析

3.3.6 Western Blot鉴定

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

附录

作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王昊

导师: 温永俊

关键词: 马鼻肺炎,马疱疹病毒型,蛋白,多克隆抗体,原核表达

来源: 内蒙古农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 内蒙古农业大学

分类号: S852.652

DOI: 10.27229/d.cnki.gnmnu.2019.000315

总页数: 43

文件大小: 2940K

下载量: 74

EHV-1多克隆抗体的制备及其皮层蛋白UL16的原核表达

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢