导读:本文包含了基因克隆表达与改造论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:糖苷酶,聚糖,基因,突变,脱氨酶,苯丙氨酸,葡萄。
基因克隆表达与改造论文文献综述
仇海燕[1]（2017）在《嗜冷木聚糖降解酶的基因克隆、重组表达及分子改造》一文中研究指出木聚糖是植物细胞壁的主要组成成分,它的完全降解需要多种降解酶的共同作用,其中木聚糖酶和木糖苷酶是木聚糖降解过程中的关键酶。木聚糖降解酶已经广泛的应用饲料、食品、造纸和生物能源等多个工业领域。近年来,人们发现在食品加工等行业中应用嗜冷木聚糖降解酶可以有效减少产品活性成分、风味物质和营养成分的损失,降低生产成本。然而,目前发现的木聚糖酶和木糖苷酶绝大多数都属于中高温酶(http://www.brenda-enzymes.org),已报道有基因序列和酶学性质研究的低温木糖苷酶仍然匮乏,亟待发掘性质优良的嗜冷木聚糖酶和木糖苷酶基因资源,并对其嗜冷机制进行研究,本研究获得了一个序列和性质新颖的嗜冷木聚糖酶Xyn27,并且对嗜冷木糖苷酶AX543的嗜冷机制进行了初步分析和突变研究。具体如下:通过Touch-down PCR和热不对称交错(TAIL) PCR方法,从枝顶孢属菌的基因组DNA中获得了 GH10家族(Xyn27)的新型木聚糖酶,Xyn27包含一个信号肽(20个残基),编码346个氨基酸,与报导的GH10木聚糖酶(XM_003662144)最高一致性为83 %。重组Xyn27在毕赤酵母GS115中成功表达,最适诱导条件为35℃、48h。Xyn27是一种嗜冷木聚糖酶,其中在35℃时的活性最高,在20℃,10℃和0℃下的相对活性仍为60.25%, 38.70%和10.8%。进一步分析表明,与嗜温或嗜热的对应物相比,Xyn27具有较少的精氨酸而有更多的丙氨酸残基。Xyn27的最适pH为7.0,在3.0～9.0的pH范围内反应lh后仍较稳定。此外,Xyn27对于大多数金属离子和有机溶剂有耐受性,优于其他GH10嗜冷木聚糖酶,其中对于重金属离子Ca2+,. Mn2+和Zn2+活性显着增强。性质研究表明,以1%榉木木聚糖为底物时的Km,Vmax,kcat和 kcat . Km-1 分别为 13.42 mg . mL-1, 9.07 umol · min-1 . mg-1, 192.98 min-1和 14.38 mL.min-1.mg,Xyn27可将木聚糖完全降解为木二糖。基于木聚糖酶Xyn27的嗜冷活性和金属离子耐受性,表明其在基础研究和食品等行业有潜在应用。木糖苷酶AX543最适温度为25℃,为目前报道的最适温度较低的酶,通过一系列的序列分析和结构比对,推断loop区结构的差异可能是低温酶嗜冷的主要原因之一,其次还包括氨基酸残基的不同,经分析发现AX543在5个位置的loop区存在显着差异,分别是 loopl (31-46)、loop2 (54-59)、loop3 (164-183)、loop4 (209-224)和 loop5(296-298),于是针对这些位置,设计引物进行突变,成功获得六个质粒,其中前五个突变体成功在毕赤酵母中表达,但由于活性均比较低,未进行下一步研究。(本文来源于《天津科技大学》期刊2017-06-01）
杨媛,姚甜甜,熊海涛,杜丽琴,韦宇拓[2]（2017）在《田菁根瘤菌嗜盐α-淀粉酶的基因克隆表达与分子改造》一文中研究指出【目的】克隆表达田菁根瘤菌嗜盐α-淀粉酶基因,并对其进行基因改造,为探索与嗜盐性相关的氨基酸位点提供参考。【方法】从田菁根瘤菌及周围土壤的宏基因组中克隆到一个命名为RSA的极端嗜盐淀粉酶。通过与同源性为75.33%的嗜盐α-淀粉酶K6的序列比对发现,RSA-D205位点与已报道的K6-N204(嗜盐相关的氨基酸位点)相似,从而对其进行定点饱和突变以研究相关酶学性质。【结果】共获得17个突变子,其最适NaCl浓度较RSA均有不同程度的降低。RSA-D205R、RSA-D205C酶反应温度高达80℃,拓宽了其应用范围。【结论】RSA-D205氨基酸残基位点与Na~+结合位点有一定的联系;另外,精氨酸(R)、半胱氨酸(C)对淀粉酶的高温改造具有参考价值。(本文来源于《广西科学》期刊2017年02期）
黄楠,朱龙宝,周丽,周哲敏[3]（2015）在《鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶的基因克隆、表达及最适反应pH改造》一文中研究指出【目的】表达鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶(AvPAL),并经分子改造降低其最适反应pH。【方法】PCR克隆AvPAL编码基因,并在大肠杆菌中表达,用Ni2+亲和层析柱和凝胶柱纯化重组蛋白。利用GETAREA软件筛选与催化残基距离较近的暴露于酶分子表面的氨基酸位点,将其突变为带电性质不同的氨基酸,并对突变体进行酶学性质研究。【结果】在大肠杆菌中成功表达了AvPAL,纯化后得到电泳纯的重组酶。突变体E75Q和E75R的最适反应pH从8.5分别偏移到7.5和7.0。E75Q在pH7.5时的比酶活较原酶提高了25%,在pH6.5–9.5之间酶的稳定性良好,其最适反应温度为50°C,在此温度下保温1h酶活无显着变化。在最适反应条件下,E75Q的kcat/Km值较原酶提高了26.6%。【结论】改变AvPAL酶分子中起路易斯碱作用的关键氨基酸残基(质子受体)附近与之有相互作用的氨基酸的带电性质,降低了AvPAL的最适反应pH,提升了其在医疗领域的应用前景。(本文来源于《微生物学通报》期刊2015年07期）
于晶晶[4]（2014）在《Thermus ruber海藻糖合成酶的基因克隆表达、酶学性质研究及分子改造》一文中研究指出海藻糖合成酶是一种分子内转糖基酶,它可以催化麦芽糖生成海藻糖,同时也可以作用于蔗糖生成海藻酮糖。由于海藻糖和海藻酮糖都有保湿、保鲜等特点,因此在工业生产上有巨大的市场潜力。了解海藻糖合成酶的酶学性质及其催化特性对于工业生产海藻糖和海藻酮糖具有重要的意义,分析海藻糖合成酶与底物结合位点及催化机制为了解该酶的空间结构及功能奠定了基础。从Thermus ruber中克隆的海藻糖合成酶基因导入E.coil XL-10Gold菌株中表达,通过镍柱亲和层析纯化得到重组酶TR-TreS,并对其进行酶学性质研究。研究结果表明,重组酶TR-TreS以麦芽糖为底物时,最适pH为6.5,最适温度为55℃,比活力为6.67U/mg, HPLC分析该酶能够催化麦芽糖和海藻糖的互逆反应,能够将麦芽糖转化成86%的海藻糖,同时生成14%的葡萄糖副产物；以蔗糖为底物时,最适pH为6.5,最适温度为55℃,在4℃保藏60d后仍有较高酶活,比活力为1.21U/mg, HPLC分析其能够将蔗糖转化成66%的海藻酮糖,同时生成34%的葡萄糖和果糖副产物。定点突变研究表明：突变菌Y205L+E206K不能利用蔗糖,对麦芽糖和海藻糖利用能力明显下降；突变菌Y205L不能利用蔗糖,对麦芽糖的利用能力提高了约0.1倍,对海藻糖利用能力下降；突变菌E206K利用蔗糖、海藻糖和麦芽糖的能力下降。由此推测这两个氨基酸位点对酶与海藻糖、麦芽糖、蔗糖的结合位点很重要。对突变菌E206K进行定点饱和突变,结果显示突变菌E206V和E206W不能转化蔗糖和麦芽糖,且对海藻糖利用率很低；突变菌E206C、E206S和E206R不能转化蔗糖,并且利用麦芽糖和海藻糖的能力下降。研究突变菌Y205L的酶学特性,结果显示该突变酶最适pH为7.0,最适温度为50℃,比活力为7.6U/mg, HPLC分析该突变酶也可催化麦芽糖和海藻糖的互逆反应,能将麦芽糖转化成92%的海藻糖,同时生成8%的葡萄糖副产物。(本文来源于《广西大学》期刊2014-06-01）
焦静雨[5]（2014）在《木糖还原酶基因克隆及表达菌株的代谢工程改造》一文中研究指出木糖醇是一种五碳糖醇,其化学名称为1,2,3,4,5-戊醇,分子式为C5H1205,是一种白色结晶,它的溶解度、溶液密度和折光系数等理化性质与蔗糖基本相同,可以作为蔗糖的替代品和糖尿病人的营养剂而受到人们的关注。本文首先通过PCR从粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)基因组中获得目的基因木糖还原酶基因(Xr),构建表达质粒pET30a-xr,并分析重组质粒在E.coli BL21(DE3)中的表达情况。结果表明分子量大小为38kDa的木糖还原酶(XR)能有效表达,重组菌株XR的比酶活为7.25U/mg。其次,XR为NADPH依赖型的酶,本文通过PCR从大肠杆菌K-12基因组中分别获得辅酶再生基因6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(gnd)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(zwf),构建表达质粒pCDFDuet-gnd、pCDFDuet-zwf、 pCDFDuet-gnd-zwf,并分析重组质粒在E.coli BL21(DE3)中的表达情况。结果表明分子量大小为51kDa的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGDH)、54kDa的葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6PDH)均得到有效表达,重组菌株6-PGDH的比酶活为2.26U/mg,G6PDH的比酶活为1.31U/mg。论文通过共表达pET30a和pCDFDuet-1系列的载体,强化了NADPH的再生,提高木糖醇的转化效率。在此基础上,论文优化了表达细胞的木糖代谢途径,采用Red/ET技术成功敲除了大肠杆菌基因组中D-木酮糖激酶(XK)的基因(xylB),减弱了木糖通过木酮糖的磷酸化生成5-磷酸-D-木酮糖进入磷酸戊糖途径,被菌体生长代谢利用。论文通过比较xylB基因敲除前后木糖对木糖醇的转化率,明确了基因敲除对提高木糖的利用效率和木糖醇产率的作用。最后,论文通过对培养基组成及培养条件(种龄、初糖浓度、温度、pH和接种量等)的优化,获得了工程菌生物转化生产木糖醇的最佳条件：种龄为12h,初糖浓度为60g/L,温度为28℃,pH为7.0,接种量为10%。摇瓶发酵结果显示,优化前重组菌株产木糖醇的生产速率是0.88g/(L·h),优化后木糖醇的生产速率是1.04g/(L·h),提高了24.32%。(本文来源于《浙江大学》期刊2014-01-16）
杨辉[6]（2012）在《芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶基因克隆、表达及分子改造》一文中研究指出果聚糖(Fructan)包含低聚果糖、高聚果糖,是一类主要以果糖残基为单体聚合而成的多糖,分子量范围分布较广。高聚果糖通常分为两大类,一类主要由β-(2,1)糖苷键连接而成,归类为菊糖(Inulin);另一类通常是以β-(2,6)糖苷键连接而成,归类为左聚糖或细菌型果聚糖(Levan)。果聚糖已经被证实具有多种生物学活性,在抗肿瘤,抗病毒,增强身体免疫等方面都有一定的效果。果聚糖还具有增强免疫应激,改善肠道失衡的功能,并且是一种很重要的食品添加剂,可以用于益生元、膳食纤维、低热食品、减肥产品、降脂产品生产,还可以作为乳化剂、保湿剂、凝胶剂等等使用。左聚糖在保湿性能上和目前化妆品行业需求大价格高昂的透明质酸具有同等效果,在化妆品行业的应用有极大潜力。地处亚热带的广西目前已经是全国最大的蔗糖生产基地,产量占全国蔗糖产量的60%以上。但是广西的蔗糖产业一直存在产品线比较单一,缺少高附加值产品的缺陷。利用蔗糖为原料开发高附加值产品符合地方经济可持续发展的需要,具有很大的意义。左聚糖蔗糖酶(levansucrase)又称为果糖基转移酶(fructosyltransferase,FTF,FTase,sucrose:2,6-D-fructan-6-D-fructosyltransferase,Lls,EC2.4.1.10),是一类可以将蔗糖水解成果糖和葡萄糖,并且可以将果糖基转移形成果聚糖的酶。本论文研究目的是利用现代微生物生物技术、分子酶工程等先进手段,克隆、表达并改造新的左聚糖蔗糖酶基因,以期提高其活力、稳定性和底物耐受性,并研究重组蛋白的酶学性质和其催化左聚糖形成的机制,为今后规模生产左聚糖打下应用研究基础。通过研究还可以比较和分析不同左聚糖蔗糖酶基因及其突变体的蛋白质结构差异和酶学性能差异,对研究糖苷水解酶大家族GH-J的催化结构域及有关左聚糖蔗糖酶活力、稳定性、产物谱的关键氨基酸残基的功能和机理研究提供理论支持。从土壤中分离了枯草芽孢杆菌sp.54A并通过物理诱变获得它的突变株sp.56A;从云南腾冲热海的温泉中分离了嗜热地芽孢杆菌sp.HB1。从比利时菌种保藏中心(BCCM)购买了Geobacillus thermoleovorans LMG9823。对所分离和购买的菌株进行了 16SrDNA序列分析比对,构建了它们之间的系统发育树。根据Genebank公布的左聚糖蔗糖酶序列设计引物,成功克隆了上述芽孢杆菌的左聚糖蔗糖酶基因。建立了未有报道过的一种基于 HSAB(High Concentration Sucrose and Aniline Blue Plate)筛选平板培养基的高效方法。利用苯胺兰染色选择产多糖微生物,利用培养基中高达10%的蔗糖浓度可以同时检测菌株左聚糖蔗糖酶聚合酶能力和水解能力。利用显色和水解圈双重指标筛选左聚糖蔗糖酶野生型菌株。HSAB平板的高渗透压使得它并不适合用于大肠杆菌重组子的筛选。于是我们又建立了一步法高效筛选左聚糖蔗糖酶重组子的平板选择方法。该方法是对文献报道的两步法筛选左聚糖蔗糖酶重组子方法的改进。以SS56A为模板构建了易错PCR的左聚糖蔗糖酶突变体库。通过一步法高效筛选突变体。获得了仅有一个氨基酸残基发生改变的突变体T305A(EPSS1),其在305位发生了 ALA替换THR。在左聚糖蔗糖酶SS56A的碳末端融合了来自Thermus thermophilus TtHB-8的一段与海藻糖合成酶热稳定性相关的结构域,构建了左聚糖蔗糖酶融合蛋白STHB6。分别以pSE380和pET30a(+)为基础,构建了重组左聚糖蔗糖酶SS54A、SS56A、T305A、HBR1、9823SB、融合蛋白STHB6的表达载体,在XL10 GOLD和Rossette(DE3)宿主中成功诱导表达。所得重组蛋白经过镍亲和层析纯化,达到电泳纯。对各重组左聚糖蔗糖酶的水解活力酶学性质进行了研究,结果表明它们的性质各有差异。其中SS54A的最适反应温度为35℃,最适pH为6.0,Km值为5.71 mM蔗糖;Vmax 值为 3.2341μmol/min.mg protein。SS56A 的最适反应温度为45℃,最适pHH为为6.0,Km 值为 6.216 mM 蔗糖;Vmax 值为 43.29μmol/min.mg protein。T305A 的最适反应温度为 50℃,最适 pH 为 6.5,Km 值为 14.52 mM 蔗糖;Vmax 值为 64.52μmol/min.mg protein。STHB6的最适反应温度为50℃,最适pH为6.5,Km值为7.673 mM蔗糖;Vmax值为27.70μmol/min.mg protein。研究还表明左聚糖蔗糖酶的热稳定性受到不同pH的影响。多种金属离子、表面活性剂对水解活力有显着影响。MnC12表现出最强的激活作用,柠檬酸铁铵、CaC12、DTT也有显着激活作用。而AgN03、MgC12、SDS则有明显抑制作用。突变体T305A的底物亲和力有明显下降,但是水解活力具有相对较好的热稳定性,而且催化速度有明显提升,其Vmax比模板SS56A提升了 49%。T305A还能在较高温度和高底物浓度下保持生产左聚糖的高转化率。已有大多数文献报道的左聚糖蔗糖酶聚合生成左聚糖的最适蔗糖底物浓度都在5%-10%之间。而T305A在pH7.0,30℃,25%蔗糖底物浓度条件下反应24小时最高可达到多糖对果糖转化率71.36%。融合蛋白STHB6的Km略有增高,水解蔗糖的速度有一定下降,但是其在高温下聚合生成左聚糖的效率显着提高,生成左聚糖的最适温度提高到40℃,其在25%蔗糖底物浓度时于37℃反应30小时多糖对果糖转化率可以达到80.64%。结合同源建模比对分析突变体并预测有关氨基酸残基功能。首次发现了枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶的ALA-309氨基酸残基对于该酶的热稳定性、催化速度有显着的影响。比较本研究中获得的SS54A、SS56A和T305A(EPSS1)左聚糖蔗糖酶,这叁个重组蛋白相互之间仅有一个氨基酸残基的差异。在SS54A重组蛋白中VAL替代了 ALA-309,其余氨基酸序列与SS56A完全一致。但SS54A的最适反应温度仅为35℃,而SS56A最适反应温度为45℃。SS54A的底物亲和能力(Km值为5.71 mM蔗糖)比SS56A(Km值为 6.216 mM)略高,但 Vmax(3.2341μmol/min.mg protein)值仅有 SS56A(43.29μmol/min.mgprotein)的7.5%,催化能力显着降低。目前尚未有文献报道过ALA-309氨基酸残基对左聚糖蔗糖酶结构和性能的影响。通过对重组左聚糖蔗糖酶生成左聚糖的酶学性质的研究,表明其最适温度、pH和底物浓度存在一定差异。获得的左聚糖蔗糖酶突变体T305A、STHB6显示了在高温、高底物浓度条件下保持果聚糖高转化率的性能。这些性能都是目前文献报道的左聚糖蔗糖酶较为缺乏的。多数报道的左聚糖蔗糖酶聚合果聚糖的最适底物浓度仅为5%-10%,一些酶合成果聚糖的最适温度为4℃,这些都是会影响实际生产的限制因素。我们的突变体酶具备了在高温(40℃)、高底物浓度(25%蔗糖)条件下的高转化率(对果糖70%-80%),具备了潜在的生产应用价值。总之,通过研究,我们建立了新的高效的左聚糖蔗糖酶野生菌和重组子筛选平台,筛选到多个性能优异的左聚糖蔗糖酶基因,并通过分子改造获得了性质不同的突变体酶,发现了一些和左聚糖蔗糖酶催化功能密切相关的重要氨基酸残基,这对于深入研究左聚糖蔗糖酶催化结构域以及具有同类催化结构域的糖苷水解酶家族GH68中相关酶的关键氨基酸残基的功能具有重要意义。(本文来源于《广西大学》期刊2012-12-01）
乔宇[7]（2012）在《Ⅰ型普鲁兰酶产业菌的筛选及其基因克隆、分子改造和高密度发酵表达研究》一文中研究指出普鲁兰酶(pullulanase，EC3.2.1.1/41)是一类淀粉脱支酶，能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1,6糖苷键，切下整个分支结构，形成直链淀粉。普鲁兰酶能分解支链淀粉的特性决定了它在淀粉加工相关工业中的广泛应用,已成为淀粉酶制剂中一个很有前途的新品种。将普鲁兰酶作为饲料添加剂应用于动物养殖中具有广阔的应用前景。首先普鲁兰酶能消除饲料原料中支链淀粉所形成的抗营养因子，同时与动物内源和外源淀粉酶协同作用，有效地促进动物对饲料中的营养物质的消化吸收，提高饲料利用率，提高动物的抗病能力。本论文以筛选饲用普鲁兰酶为目标，筛选普鲁兰酶产生菌，克隆、表达普鲁兰酶基因和高密度发酵生产普鲁兰酶。主要研究工作如下：1利用平板涂布法从淀粉加工厂附近土壤中分离到一株产普鲁兰酶的细菌H4，通过形态学、生理生化试验及16S rDNA分类鉴定，确定该细菌为一株微小杆菌(Exiguobacterium sp. H4)。对筛选到的菌株培养基成分及产酶条件进行了优化，在优化条件下，发酵72h后胞外产生普鲁兰酶的活力可达6.35U/mL，比复筛的产量3.02U/mL提高了110.2%。2根据普鲁兰酶蛋白序列保守区，利用CODEHOP法设计简并引物并克隆得到了来源于Exiguobacterium sp. H4的普鲁兰酶部分编码基因。利用TAIL-PCR获得了基因全长序列，Genbank登录号：JQ686229。通过生物信息学分析，该酶为I型普鲁兰酶，属糖苷水解酶13家族。3将Exiguobacterium sp. H4原始普鲁兰酶基因和改造普鲁兰酶基因在大肠杆菌中进行了表达。构建了6个大肠杆菌表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS，6个不同的重组普鲁兰酶在大肠杆菌宿主中均有表达。重组普鲁兰酶酶活力最高为N端缺失100个氨基酸残基的重组普鲁兰酶（ExPulA1R），研究了该酶的酶学性质。重组普鲁兰酶的最适反应温度为50℃，最适反应pH为6.0；对金属离子和化学试剂有较强的抗性，Co~（2+）对酶活力有较明显的激活作用；该酶作用于含有α-1,6-糖苷键的底物普鲁兰糖、可溶性淀粉和支链淀粉；酶解普鲁兰糖产物主要是麦芽叁糖、麦芽糖和葡萄糖等的混合物。重组普鲁兰酶能够抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解。4在摇瓶培养的基础上，建立了大肠杆菌工程菌产普鲁兰酶的高密度发酵工艺。重组大肠杆菌的高密度发酵使用合成培养基，补料阶段采用指数流加的工艺，在设定细胞的比生长速率为0.12的前提下，限制补料中碳源的供应，有效阻止乙酸的产生。当细胞密度OD_(600)达到70.0开始诱导，最终细胞干重为53.3mg/mL，普鲁兰酶活力达到67.0U/mL。本研究首次报道微小杆菌属细菌产普鲁兰酶，以这株微小杆菌基因组为模板克隆得到了普鲁兰酶新基因。原始普鲁兰酶基因和改造普鲁兰酶基因在大肠杆菌中获得了稳定的表达。在国内首次建立了基于重组大肠杆菌葡萄糖产出系数的指数流加高密度发酵工艺，对普鲁兰酶的工业化生产具有指导意义。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2012-06-01）
李国庆[8]（2012）在《黑曲霉cbh1基因和耐高糖bgl1基因克隆表达及定向改造》一文中研究指出纤维素酶是一种复合酶，它包括外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。叁种酶之间需要相互协同作用才能将天然纤维素降解为葡萄糖。论文以黑曲霉（Aspergillus nigerNL-1）为出发菌株，对外切葡聚糖酶基因cbh1进行了克隆、表达和改造；对β-葡萄糖苷酶基因bgl1进行了全基因优化以及耐高糖的分子定向改造；对β-葡萄糖苷酶改善银杏茶品质进行了初步探索。主要研究结果如下：(1)以Aspergillus niger NL-1基因组DNA为模板，利用PCR方法成功获得了外切葡聚糖酶基因cbh1；序列比对分析表明，其全长1515bp，含3个内含子，与其它曲霉cbh1基因有较高的同源性，且属于G7家族。(2)成功构建了毕赤酵母表达质粒pPICZαA-cbh1和重组菌株KM71H-cbh1，实现了较高水平的表达，CBHⅠ酶活最高为125U/L。SDS-PAGE显示其在60kDa左右出现特异性条带。重组CBHⅠ的最适温度与pH分别为60oC和4.0，且其具有较好的热稳定性和较为广泛的pH适用范围。(3)将cbh1基因中活性部位附近的6个稀有密码子突变为毕赤酵母表达的偏爱密码子。获得高表达量的重组菌株KM71H-cbh1m。优化后的基因cbh1m在毕赤酵母KM71H中的表达量达173U/L，比未优化的提高了17%。(4)成功构建含pGAP启动子的重组质粒pGAPZαA-cbh1并转化毕赤酵母KM71H，得到高表达量的重组菌株KM71H-GAP-cbh1。其在发酵第3d产外切葡聚糖酶酶活达到最高为210U/L，且其产CBHⅠ的最高比活力为5494U/g。(5)对已克隆的黑曲霉来源的bgl1基因进行全基因优化，在毕赤酵母GS115中实现高效表达，摇瓶最高酶活力达到41.21U/mL，是未优化前的1.5倍。进一步提高其拷贝子数后摇瓶最高酶活可达53.2U/mL。(6)从银杏茶叶中提取黄酮类化合物和挥发油类化合物，利用β-葡萄糖苷酶酶解并通过HPLC和GC-MS检测分析表明，酶解后的黄酮苷类化合物的含量明显降低，苷元类化合物及具有花果香的物质含量都有了较大幅度的提高。(7)采用了叁种方法提高β-葡萄糖苷酶的耐高糖特性。一是通过用pGAP启动子替换表达系统中的pAOX1启动子，β-葡萄糖苷酶耐糖系数Ki达到82.08mM，是更换前的3倍；二是通过与相关序列的比对，利用定点突变技术对预测的11个位点进行突变，结果表明，突变713位点，Ki值有所提高；叁是直接对原始黑曲霉进行多轮耐高糖驯化，提取其bgl1基因并与原基因比对，结果发现3个位点即1，522和685发生突变，设计8种突变方式对这3个位点进行了定点突变。(本文来源于《南京林业大学》期刊2012-06-01）
李安娜,徐荣艳,申晨,郭晓红,李多川[9]（2010）在《嗜热毛壳菌热稳定酶的基因克隆、表达及分子改造》一文中研究指出嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)是一种生长上限温度较高的嗜热真菌,它能够产生很多具有重要工业价值的热稳定酶。本研究从该嗜热真菌中分别克隆和表达了1种脂肪酶、1种β-葡萄糖苷酶基因和1种β-1,3-葡聚糖酶。它们的cDNA序列分别长870bp、3213 bp和2765bp,在GenBank中的登录号分别为EU370914、EF648280、GQ149728。叁个基因分别克隆到酵母分泌型表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母GS115,成功实现了热稳定酶在中温菌中的表达。重组酶纯化后进行性质研究表明,重组脂肪酶LM分子量为35kDa,最适反应温度和pH分别为60℃和10.0,该酶在60℃稳定,70℃的半衰期为40min,在pH值为9.0～11.0之间保持稳定的酶活性;重组β-葡萄糖苷酶BGL的分子量约为119 kDa,最适反应温度和最适pH值分别为60℃和5.0,该酶在60℃稳定,70℃保温10 min后剩余酶活为29.7%;重组的β-1,3-葡聚糖酶GLU-N分子量约为94kDa,最适反应温度和pH分别为60℃和5.0,70℃保温60min仍具有60%的酶活性,在pH值为4.0～7.0之间保持稳定的酶活性。(本文来源于《2010年中国菌物学会学术年会论文摘要集》期刊2010-08-14）
徐荣燕[10]（2010）在《嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造》一文中研究指出纤维素是地球上最丰富的碳水化合物,可被纤维素酶降解转化成为葡萄糖,对于人类社会解决能源危机、食物短缺和环境污染具有重大的现实意义。传统上采用化学方法控制纤维素降解难度大、成本高,对环境污染严重,而纤维素的生物降解有效克服了这些问题。纤维素酶是一类能够水解纤维素β-D-糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称,纤维素的彻底降解需要内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶叁种组分的协同作用,β-葡萄糖苷酶是纤维素酶解的瓶颈。在纤维素水解时,增加β-葡萄糖苷酶活性,会有效提高纤维素酶解效率。近些年来,许多专家学者通过分子生物学等手段不断提高酶活力和获得新性能的重组纤维素酶。糖化酶是一种具有外切活性的酶,它能从非还原性末端水解淀粉、糊精、糖原等的α-1, 4-葡萄糖苷键,得到终产物β-D-葡萄糖,是淀粉转化为葡萄糖过程中的主要酶类之一。糖化酶已在酿造、食品、医学等工业和农业领域中得到了广泛的应用,具有重要商业价值。但市场应用的糖化酶主要来源于常温菌,因其酶活力和产率低,热稳定性差导致产品成本高,储存期短,而制约糖化酶在农业、工业上的应用。由此可见,热稳定性糖化酶的研究和开发具有重要意义。疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)和嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum CT2)是广泛分布的,生长上限温度较高的嗜热真菌,从这两种真菌中已分离了多种嗜热酶,具有极大的研究和应用价值。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR从嗜热毛壳菌中首次分离到了一个新的β-葡萄糖苷酶基因,GenBank登录号为EF648280,序列分析表明该基因全长核酸序列为3213 bp,包含一个2604 bp的开放阅读框ORF,编码867个氨基酸的蛋白质,酵母表达后酶蛋白表达量为1.644 U/mg,经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换等步骤纯化了该重组蛋白,SDS-PAGE显示该重组蛋白大小约为119 kDa,比推测的蛋白分子量稍大,可能与该蛋白的糖基化有关。重组酶的最适反应温度和最适pH值分别为60℃和5.0,该酶具有较高的热稳定性,70℃保温10 min后剩余酶活为29.7 %。本研究还从疏绵状嗜热丝孢菌中克隆到一种糖化酶基因(GenBank登录号为EF545003)并将其在毕赤酵母中进行了高效表达,经甲醇诱导表达后酶活最高可达11.6 U/mL,经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换等步骤纯化了该重组蛋白,SDS-PAGE显示该重组蛋白大小约为67 kDa,该重组酶的最适反应温度和最适pH值分别为60℃和5.0,在pH 4.0-9.0的范围内是很稳定的。对来自嗜热毛壳菌的β-葡萄糖苷酶基因的非保守氨基酸和保守氨基酸进行定点突变。叁个非保守氨基酸的突变为K275R、N276S和279D,表达筛选后发现与原始菌GS-BGL相比,叁个突变子的酶活都有不同程度的降低,突变子的酶活分别是原始菌酶活的81.3 %、63 %和65 %,但最适反应温度均提高了5℃;突变子N276S和G279D的最适pH由5变为4,而突变子K275R最适pH值仍保持在5;在热稳定性方面,叁个突变子表现不同,60℃处理60 min,突变子G279D稳定性提高最多,仍有80.6 %的酶活,突变子N276S稳定性次之,酶活剩余72.1 %,原始酶仅剩69.55 %的活性,而突变子K275R酶活剩余59.5 %,与原始酶相比稳定性下降。而当保守氨基酸第287位的天冬氨酸突变为非亲核的甘氨酸后,突变子失去了糖苷水解酶的活性,证明了该氨基酸为维持水解酶活性的必需氨基酸,但目前还没有检测到糖苷合成酶的活性。由于定点突变主要是针对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换,蛋白的高级结构基本保持不变,而且本研究中的β-葡萄糖苷酶的结构迄今为止还没有报道,因而对酶蛋白的改造有限。为了提高β-葡萄糖苷酶的酶活力和稳定性,采用定向进化的方法对β-葡萄糖苷酶的基因进行改造。本研究以β-葡萄糖苷酶bgl基因为出发基因,采用易错PCR的方法建立突变体文库,以高活力为筛选压力,筛选方法采用平板荧光初筛和小量发酵法相结合。经过突变和筛选,获得了一个酶活力提高0.74倍的突变体,序列测定表明:突变基因与出发基因比较,突变子BE857有6个氨基酸发生了变化。通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析等步骤纯化了该蛋白,酶学性质与出发酶进行了比较,该突变酶的最适温度为65℃,比出发酶提高了5℃,最适pH与出发酶一致均为5.0,在稳定性方面,突变子株BE857有所提高,60℃处理1 h后酶活仍剩余75.58 %,而出发菌株剩余酶活为69.55 %。(本文来源于《山东农业大学》期刊2010-06-07）
基因克隆表达与改造论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
【目的】克隆表达田菁根瘤菌嗜盐α-淀粉酶基因,并对其进行基因改造,为探索与嗜盐性相关的氨基酸位点提供参考。【方法】从田菁根瘤菌及周围土壤的宏基因组中克隆到一个命名为RSA的极端嗜盐淀粉酶。通过与同源性为75.33%的嗜盐α-淀粉酶K6的序列比对发现,RSA-D205位点与已报道的K6-N204(嗜盐相关的氨基酸位点)相似,从而对其进行定点饱和突变以研究相关酶学性质。【结果】共获得17个突变子,其最适NaCl浓度较RSA均有不同程度的降低。RSA-D205R、RSA-D205C酶反应温度高达80℃,拓宽了其应用范围。【结论】RSA-D205氨基酸残基位点与Na~+结合位点有一定的联系;另外,精氨酸(R)、半胱氨酸(C)对淀粉酶的高温改造具有参考价值。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
基因克隆表达与改造论文参考文献
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[9].李安娜,徐荣艳,申晨,郭晓红,李多川.嗜热毛壳菌热稳定酶的基因克隆、表达及分子改造[C].2010年中国菌物学会学术年会论文摘要集.2010
[10].徐荣燕.嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D].山东农业大学.2010
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