苏丽[1]2003年在《重组血小板糖蛋白Ibα对血小板聚集抑制作用的研究》文中认为血小板膜表面糖蛋白Ⅰbα(GPⅠbα)与vWF的结合引起的血小板与受损血管内皮的粘附，在初期止血和血小板血栓形成中起着至关重要的作用。因而，许多研究致力于以GPⅠbα和vWF二者为靶点的新的抗血栓药物的研制和开发。目前文献报道的抗血栓制剂包括抗vWF单克隆抗体、与GPⅠb结合的蛇毒蛋白、与vWF结合的金精叁羧酸和重组vWF片段VCL等。所有这些研究表明，基于GPⅠbα和vWF相互作用抑制剂的抗血栓治疗具有潜在的可行性。但是尽管以GPⅠbα为靶点具有潜在的治疗优势，这方面的发展仍很缓慢，而vWF分子GPⅠb结合区的重组片段虽然阻止血小板黏附，延缓血栓形成，但不阻止血栓形成，需要与阿司匹林或溶栓药合用。 我们设想，GPⅠb作为vWF的天然配体，与vWF有最佳的结合特性。可溶性的GPⅠb蛋白与血浆中和内皮下的vWF结合后，可使vWF不能与血小板上的GPⅠb结合，从而阻断血小板在内皮下的黏附。同时vWF与GPⅡb-Ⅲa的结合也会受到影响，并进一步影响血小板的聚集功能，从而达到防止血栓形成的目的。 基于以上假设，本研究以vWF为靶点，通过获得GPⅠba之vWF因子结合域(GP302)的重组蛋白，对其在体外能否与血浆中的VWF结合，竞争性抑制vWF与血小板膜上GPⅠba的结合，从而抑制血小板的聚集进行了初步的研究。 为了检测血小板糖蛋白GPⅠbα在哺乳动物细胞中的表达，本研究在大肠杆菌中表达了GST-GP302融合蛋白并制备了多抗。首先，将GP302片段插入GST融合表达载体pGEX-4T-1，重组载体酶切鉴定后，在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-GP302融合蛋白，包涵体经变性复性后免疫新西兰白兔叁次，在最后一次免疫后的第七天收集抗血清，ELISA测定其效价，Western blot检测多克隆抗体对血小板GPⅠbα的特异性结合。结果表明，GP302基因已正确插入到pGEX-4T-1中，经IPTG诱导后，表达出相对分子量约为59的融合蛋白，获得了效价为10~(-5)的多克隆抗体。Western blot证明所制备的多抗可以与血小板糖蛋白Ⅰba特异性结合。 随后，为了获得具有与vWF结合活性的重组蛋白，本研究将GP302片段插入到真核表达载体，构建pSecTaq2／Hygro B-GP302，重组质粒酶切鉴定后，以空载体为阴性对照，通过transfast~(TM)转染试剂导入CHO细胞中，潮霉素筛选阳性克隆。用抗GP302多克隆抗体以及c-myc单抗对表达上清进行了重组蛋白的检测，由于其表达的蛋白羧基端带有6个组氨酸残基，所以我们采用Ni-NTA琼脂糖纯化重组蛋白。由于瑞斯托霉素作为诱导剂可刺激血浆中vWF与血小板膜上GPⅠba结合而硕士学位论文摘要形成血小板的聚集，所以我们用该实验初步分析了GP3OZ重组蛋白与vWF结合的活性。结果表明，GP3OZ片段正确插入到psecTaqZ/HygroB载体中，并在CHO细胞中得到表达，获得相对分子量约为33kD的重组蛋白。重组GP3OZ蛋白可以和抗GP3OZ多克隆抗体以及c一myc单抗特异性结合。在瑞斯托霉素诱导的血小板聚集实验中，重组蛋白可以与血浆中的vWF结合，竞争性抑制vWF与血小板膜上GPIba的结合，抑制血小板的聚集。 综上所述，本研究根据GPIba和vWF相互作用在动脉血栓形成中的重要作用，制备了可溶性重组GP工ba片段GP302，并评估了其在体外与血小板上的GP工ba竞争结合血浆中的vWF的能力。具有生物活性的rGP302蛋白的获得及其初步功能的研究，验证了以vWF为靶点进行抗血栓治疗的可行性，为动脉血栓性疾病的预防和治疗及开发新型抗血栓药物提供了一种新的思路和方法。
杨剑峰[2]2010年在《抗血小板膜糖蛋白Ibα单克隆抗体的人源化及基于膜糖蛋白Ibα结构的活性小分子化合物研究》文中认为第一部分抗血小板膜糖蛋白Ibα单克隆抗体的人源化研究研究背景血小板膜糖蛋白(GP) Ibα是血小板特异性的跨膜糖蛋白,高剪切力条件下在血管性血友病因子(VWF)的介导下与血管损伤部位暴露的胶原结合,起始血小板的黏附,进而引起血小板聚集。GPIbα与VWF结合引起的血小板黏附是动脉血栓形成的关键步骤。目的研制人鼠嵌合抗GPIbα单克隆抗体,阻断VWF与GPIbα的结合,为开发新型抗血小板药物提供基础。方法和结果采用5’快速扩增cDNA末端(RACE)的方法从分泌鼠源抗人血小板膜糖蛋白GPIbα单克隆抗体(SZ2)的杂交瘤细胞中分别扩增重链和轻链的可变区序列和信号肽序列,装入克隆载体后测序,经IMGT网站序列比对,确认是抗体序列后设计引物,PCR扩增后分别将重链和轻链可变区序列连同信号肽序列克隆入含有人免疫球蛋白重链γ链和轻链kappa恒定区的带有巨细胞病毒启动子的真核表达载体中。将两个表达载体共转染二氢叶酸还原酶缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO-dhfr-/-)细胞后,在氨甲喋呤逐步加压下扩增抗体基因,筛选抗体高表达细胞克隆。用ELISA方法检测细胞培养上清中嵌合抗体重链及轻链的表达。我们筛选到一株高表达克隆,即3G09,1×106细胞24小时的表达量可达2.5μg。Western blot方法检测到非还原条件下150 kDa的完整抗体条带,还原条件下50 kDa和25 kDa的分别代表重链和轻链的条带。收集培养上清后用蛋白A柱纯化,纯化后的嵌合抗体经SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝染色,结果同样显示非还原条件下150 kDa的完整抗体条带和还原条件下50 kDa和25 kDa的条带,且纯度在95 %以上。流式细胞术检测纯化的嵌合抗体能与表达GPIb的CHO细胞结合。纯化后的抗体用木瓜蛋白酶处理,酶切产物用蛋白A柱处理以去除未酶切完全的完整抗体和Fc片段,收集Fab片段后经SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝染色,检测Fab纯度在90 %以上。血小板聚集试验发现嵌合SZ2 Fab能够抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集,且抑制效果呈剂量依赖性。此外,嵌合SZ2 Fab在10μg/ml浓度下抑制流动小室中血小板在固定化的VWF上的黏附。结论构建了人-鼠嵌合抗体的表达载体并在CHO细胞中成功的进行了嵌合抗体的表达;嵌合Fab片段具有潜力开发成预防和治疗动脉血栓的新型抗体药物。第二部分基于血小板膜糖蛋白Ibα结构的活性小分子化合物研究研究背景血浆VWF结合血小板GPIbα是高剪切力状态下血小板黏附的起始步骤,通过GPIb的信号转导,最终导致血小板αIIbβ3整合素的活化。目的筛选抑制VWF与GPIbα相互作用的小分子化合物。方法和结果我们采用虚拟筛选的方法用DOCK4.0软件将SPECS化合物库中的所有小分子化合物对接到GPIbα中的VWF结合区,选取打分前149位的小分子进行实验分析,具有抑制VWF结合GPIbα的小分子进一步做血小板功能的生物活性测试。我们发现其中一个化合物YC148具有抑制血浆VWF结合重组的GPIbαN端片段与免疫球蛋白Fc段融合蛋白的作用,但是有意思的是,该化合物不抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集,相反,YC148本身可诱导人血小板聚集,而不依赖外源性诱导剂如瑞斯托霉素和博托霉素的存在。YC148也可诱导洗涤血小板的聚集。流式细胞术显示YC148可诱导血小板膜表面P-选择素的表达及增强单克隆抗体PAC-1结合血小板的能力。YC148诱导的血小板聚集作用可被抗血小板GPIbα单克隆抗体6D1部分抑制。此外,缺乏GPIbαN端序列的血小板不能被YC148诱导聚集。结论发现了一个新的通过GPIbα诱导血小板聚集的小分子化合物,可为研究血小板黏附和聚集过程中GPIb的信号转导作用提供新的工具,也可为研究基于阻断VWF-GPIb相互作用的新型止血药提供化学结构参考。
程彦[3]2012年在《抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对血小板功能的影响》文中指出研究背景及目的：动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是血管壁在受到氧化脂质或感染等各种因素损伤的基础上，发生的慢性炎症反应。而炎症反应与凝血系统激活在动脉粥样硬化病变的发生发展过程中起着至关重要的作用。重组融合蛋白TAP-SSL5是将能够特异性地与粒细胞表面的P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1)相结合，并能显着抑制粒细胞在含P-选择素(P-selectin)表面黏附的蛋白质SSL5(staphylococcal superantigen-like protein-5,金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5)作为引导兼功能分子，与能够抑制凝血因子Xa(factorXa, FXa)活性的分子―蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide, TAP)进行融合而制备出的具有抗炎抗凝双效功能的融合蛋白。本课题组的前期研究表明， SSL5还能与血小板表面GPIbα结合，本课题进一步研究了融合蛋白TAP-SSL5对血小板功能的影响，旨在较全面地评价融合蛋白TAP-SSL5的功能。而OS-1是GPIbα的一种拮抗性多肽，能够抑制vWF-A1与GPIbα-Fc的结合，从而抑制血小板在激活血管内皮表面的黏附；本研究还进一步采用OS-1为对照，分析TAP-SSL5对体内血栓形成的影响。研究方法：1、构建融合蛋白TAP-SSL5表达载体：按本课题组前期已建立的方法，进行TAP-SSL5表达载体的转染以及该融合蛋白的纯化。2、体外实验部分：静脉血采自至少两周之内未服用过任何药物的健康志愿者，用枸橼酸钠(与全血的体积比为1:9)抗凝；进行离心后得到富含血小板的血浆(platelet-rich plasma，PRP)，以1×Tyrode’s缓冲液平衡CL-2B琼脂糖凝胶柱后，将PRP以该凝胶柱过滤，得到凝胶过滤的血小板(gel-filtered platelets，GFP)。用流式细胞仪(FACS)检测融合蛋白TAP-SSL5和血小板结合的情况，并检测TAP-SSL5和OS-1对小鼠抗人GPIbα单克隆抗体(HIP1)与血小板结合的竞争性抑制作用；用流式细胞仪检测血小板表面CD62P的表达和PAC-1的结合量，以观察TAP-SSL5和OS-1对血小板的激活作用；采用Chrono-Log血小板聚集仪检测融合蛋白TAP-SSL5对全血(或PRP)血小板聚集的影响；并观察融合蛋白TAP-SSL5对血小板在纤维蛋白原表面静态黏附的影响。采用JC-1试剂盒和FACS检查，进一步研究了OS-1对血小板线粒体膜电位的影响，以期阐明OS-1对血小板功能影响的机制。3、动物实验部分：选取昆明小鼠，检测TAP-SSL5对小鼠尾部出血时间的影响。经尾静脉一次性注射不同剂量的TAP-SSL5，在距离小鼠尾尖5mm处截断，浸入温生理盐水中，记录出血时间；采用氯化铁诱导的大鼠下腔静脉血栓形成模型，研究OS-1的抗血栓形成作用。结果：1、融合蛋白TAP-SSL5可与血小板结合，并能竞争性抑制HIP1与血小板的结合,提示TAP-SSL5可与血小板表面的GPIbα结合；终浓度为30mg/L的TAP-SSL5能激活血小板，使人血小板表面CD62P的表达和PAC-1的结合量明显增加，其阳性率分别为90.4%(p＜0.001)和66.3%(p＜0.01)；终浓度为10mg/L、30mg/L的TAP-SSL5均可引起血小板的显着聚集；30mg/L TAP-SSL5可促进血小板在纤维蛋白原表面的静态黏附；OS-1可抑制HIP1与血小板的结合；30μM OS-1可激活血小板，使人血小板表面CD62P的表达增加(阳性率39%)和PAC-1的结合量上升(阳性率40.5%)；而OS-1对血小板线粒体膜电位无明显影响。2、单次尾静脉注射10mg/kg的TAP-SSL5，能够显着延长小鼠尾部出血时间，由对照组的(647.1±33.7)s延长至(753.6±127.3)s(p＜0.01)，而常规剂量组(3mg/kgTAP-SSL5)尾部出血时间为(612.8±79.1)s，与对照组相比无显着差异(p＞0.05)。采用氯化铁诱导的大鼠下腔静脉血栓形成模型的研究结果显示，DMSO溶剂对照组的血栓重量为(17.3±5.6)mg，单次静脉注射1.22mg/kg或3.66mg/kg的OS-1，可显着抑制FeCl3诱导的大鼠下腔静脉的血栓形成，血栓重量分别为(10.5±3.5)mg(与对照组相比，p＜0.05)和(8.2±4.1)mg(与对照组相比，p＜0.01)。结论：融合蛋白TAP-SSL5保留了SSL5与血小板GPIbα结合的功能，这提示TAP-SSL5可能通过抑制GPIbα与vWF的相互作用，而进一步增强其抗血栓作用；但TAP-SSL5与GPIbα的结合也可导致其在高浓度情况下激活血小板和延长出血时间。OS-1作为GPIbα的拮抗性多肽，可抑制氯化铁诱导的大鼠下腔静脉血栓形成，但同时对血小板也有一定的激活效应；体外研究显示，OS-1对血小板线粒体膜电位无明显影响，这提示OS-1与GPIbα结合后不会导致血小板凋亡。本课题研究主要评价了融合蛋白TAP-SSL5对血小板功能的影响，这些结果提示，具有抗炎抗凝作用的融合蛋白TAP-SSL5还具有针对GPIbα的拮抗作用，从而可能抑制血小板在高剪切力状态下的黏附。通过对GPIbα拮抗性多肽OS-1的研究，显示目前的GPIbα拮抗剂可能都具有一定的血小板激活效应。因此，研发无血小板激活作用的GPIbα拮抗剂，必将具有广阔的应用前景。
申卫东[4]2011年在《血小板膜糖蛋白分子生物学特性及其抗血栓研究进展》文中研究说明血小板膜糖蛋白(glycoprotein,GP)是胶原、凝血酶、血管性假性血友病因子(vWF)、纤维蛋白原(Fg)和二磷酸腺苷(ADP)等受体的成分,参与血小板黏附、聚集和活化反应,是生理性止血和病理性血栓形成的始动环节。20世纪90年代,心血管病已逐渐成为我国城乡居民的第一位死因,占总死亡人数的近40%;而心肌梗死、脑血栓、动脉粥样硬化等发病机制均涉及血栓栓塞病理过程。为此,从分子结构方面对血小板膜糖蛋白进行研究,已成为探索血栓
杨爱军[5]2018年在《瘤源性von Willebrand Factor对肿瘤扩散能力的影响及其受黄芪多糖作用的研究》文中研究说明背景与目的:肿瘤转移过程中瘤细胞与血小板之间的相互作用被认为是一种"致死同盟",两者通过表面受体和自分泌因子相互作用致瘤栓形成促进转移,其中VWF(von Willebrand factor,VWF)可能在瘤细胞与血小板、内皮细胞间相互作用中起关键作用,但其作用及机制目前尚不清楚。临床研究显示癌症患者血浆VWF水平升高,升高的VWF水平与肿瘤的分级、转移及不良预后密切相关。这些结果提示恶性肿瘤细胞可能通过产生瘤源性VWF改变其生物学行为,促进肿瘤的血源播散,并影响患者预后。本课题拟研究胃癌组织和细胞系产生瘤源性VWF的水平及瘤源性VWF对癌细胞生物学行为的影响,并探讨黄芪多糖对VWF介导的肿瘤播散的影响。方法:1、收集人胃腺癌患者血浆,应用ELISA法检测患者血浆VWF水平,应用组织学观察及免疫组织化学染色检测不同患者胃腺癌的组织学分级、分期及癌组织VWF的表达水平,分析癌组织VWF表达水平与患者血浆VWF水平及组织学特征间的关系。2、应用免疫荧光、免疫组化、透射电镜、免疫电镜技术及Western Blotting、PCR技术检测胃癌细胞系VWF的表达情况;细胞聚集实验及粘附实验检测外源性VWF对胃癌细胞聚集及粘附的影响。3、应用基因转染技术构建过表达VWF的胃癌细胞系,结合微流体实验及流式细胞术,检测瘤源性VWF对癌细胞间粘附及癌细胞与血小板、内皮细胞间粘附的影响,并分析VWF相关受体在此过程中的作用。4、应用动物实验、小动物活体成像及数字切片技术等检测瘤源性VWF对瘤细胞血道播散及转移灶生长的影响。5、应用黄芪多糖处理动物,观察黄芪多糖对VWF介导的肿瘤播散及生长的作用;研究黄芪多糖在体外对瘤细胞增殖、粘附的影响,分析黄芪多糖对VWF介导的肿瘤播散的抑制作用及其机制。结果:对105例癌前病变及胃癌患者的组织及血液样本进行分析显示,胃癌患者血浆VWF浓度较健康受试者及癌前病变患者显着增高(P<0.05),进展期胃癌患者(TNMⅢ/Ⅳ)血浆VWF水平显着高于早期患者(TNMⅠ/Ⅱ)(P<0.05),低分化胃癌患者高于中、高分化胃癌患者(P<0.05)。免疫组化染色显示胃癌组织表达VWF,其表达水平与分化程度呈负相关((r=-0.4256,P<0.05)。免疫荧光、PCR及Western Blotting检测证实胃癌细胞系BGC823、MKN45细胞表达VWF蛋白,癌细胞VWF的表达水平受凝血酶及培养微环境影响。透射电镜及免疫电镜观察发现BGC823细胞胞浆内存在类似内皮细胞Weibel-Palade小体的超微结构,并能被纳米金偶联的VWF抗体标记。细胞聚集实验及粘附实验显示外源性VWF能促进癌细胞聚集反应,并能促进癌细胞对内皮细胞及血小板的粘附,这种促进作用能够被VWF抗体及si RNA所逆转。在微流体环境,转染了VWF全长c DNA的BGC-VWF细胞与被血小板包被的流体管道的粘附能力显着增强(P<0.01)。对VWF介导细胞间粘附的机制进行分析,发现GP Ibα抗体能抑制胃癌细胞对血小板及内皮细胞的粘附;应用Integrin抗体能抑制BGC-VWF细胞与血小板的粘附反应;PI3K抑制剂能够抑制胃癌细胞VWF的分泌,并能抑制其对血小板及内皮细胞的粘附。NOD/SCID小鼠体内实验显示经尾静脉注射BGC-VWF细胞的小鼠具有更差的预后,小动物活体成像数据显示BGC-VWF组小鼠体内荧光信号增强显着,隔日给予小鼠黄芪多糖注射液处理,能够降低体内荧光信号的增强,对各组小鼠肺组织的荧光成像及数字切片组织学研究显示,与转染了空质粒的BGC-Sham组比较,BGC-VWF组小鼠的肺平均荧光信号和肺荷瘤面积比值显着增高,黄芪多糖的实验性治疗能够降低肺平均荧光信号和肺荷瘤面积比值。应用体外实验研究发现黄芪多糖并不能改变癌细胞基于血小板的聚集与粘附能力,但能降低血管内皮细胞VWF的表达和释放,降低内皮细胞与癌细胞的粘附能力,黄芪多糖还能抑制肿瘤细胞增殖,并促进癌细胞凋亡,促进肿瘤免疫。结论:人胃腺癌组织及胃癌细胞系能够产生VWF,瘤源性VWF能够促进癌细胞的聚集,并通过与GP Ibα、Integrin相互作用促进癌细胞对血小板及内皮细胞的粘附,促进癌细胞经由血道发生肺转移。黄芪多糖通过抑制内皮细胞-癌细胞粘附、抑制肿瘤增殖、促进癌细胞凋亡并促进肿瘤免疫抑制过表达VWF的胃癌细胞肺内转移灶的生长。
马珍妮, 董宁征, 白霞, 杨剑峰, 谢丽倩[6]2010年在《人血小板膜糖蛋白GPIbα(H1-V289)的原核表达及其生物活性研究》文中研究表明目的获得重组的血小板膜糖蛋白GPIbα的N端片段(1-289氨基酸),进一步研究其在血栓与止血过程中的生物功能。方法利用质粒pCMV3(编码GPIbαH1-V289)设计引物,构建pQE30-GPIbα(H1-V289)表达载体,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达蛋白。用Ni-NTA琼脂糖层析柱不同pH值梯度淋洗法纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化产品纯度和免疫学活性,并观察重组蛋白对瑞斯托霉素和ADP诱导血小板聚集的影响。结果成功获得纯度较高的重组GPIbα(H1-V289)蛋白,浓度为0.6 mg/ml。Western blot检测结果显示,抗GPIbα单抗SZ2能在34 kd区域显示条带。而且纯品能有效抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集,对ADP诱导的反应无抑制作用。结论重组蛋白具有较好的免疫原性和生物活性,并可以大量获得,为开发抗血栓药物奠定了基础。
李婷婷[7]2015年在《安菲博肽对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究》文中研究指明缺血性脑血管疾病是指由于多种因素引起脑血流中断,造成局部区域缺血缺氧,从而导致神经功能障碍的一类中枢神经系统常见病和多发病。临床采用的溶栓治疗和机械再通可及时恢复血液供应,但不可避免会继发严重的缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury),进一步加重病情。本课题所用的安菲博肽(Anfibatide,ANF)是从我国皖南尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化得到的多肽,是一种特异性血小板膜糖蛋白(glycoprotein,GP)Ib受体拮抗剂。本课题组已报道了ANF可以有效降低脑缺血再灌注损伤模型小鼠的脑梗死体积并且促进神经功能恢复。本课题进一步研究了ANF对脑缺血再灌注损伤小鼠的保护作用及其可能的作用机制。目的:探讨安菲博肽(ANF)对急性局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及其可能的作用机制。方法:使用改良线栓法制备小鼠右侧大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)致局灶性脑缺血再灌注模型。雄性昆明小鼠随机分为:假手术组,模型组,ANF(1,2,4 ug/kg)组和阳性药替罗非班(Tirofiban,TRF,0.5 mg/kg)组。缺血90 min再灌注1 h后尾静脉给药。再灌注24 h,分别检测各组小鼠以下指标:磁共振T2加权成像法(T2-weighted imaging,MRI-T2WI)测脑梗死体积;改良神经功能缺损评分法(modified neurological severity score,m NSS)进行神经功能评分;爬板实验观察平衡和运动功能;尼氏染色和苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin,HE)染色分别观察缺血脑组织神经元完整性和微血栓数量变化;伊文思蓝法(evans blue,EB)观察血脑屏障通透性改变;免疫荧光双标法(immunofluorescence,IF)检测缺血脑组织血小板膜糖蛋白(platelet membrane glycoprotein,GP)Ibα和血管假性血友病因子(von Willebrand Factor,v WF)的表达;免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测缺血脑组织P-选择素(P-selectin)和巨噬细胞分化抗原-1(macrophage-1 antigen,MAC-1)蛋白的表达;IHC和免疫印迹法(western blotting,WB)检测缺血脑组织纤维蛋白(Fibrin(ogen))的表达;测定尾静脉出血时间观察止血功能;darkbin’s法观察缺血脑组织出血含量;测定血小板计数观察血小板数量变化。结果:ANF能明显降低缺血再灌注小鼠脑梗死体积,改善神经功能和运动协调功能;提高完整神经元数量以及减少脑内微血栓数量;降低血脑屏障通透性,降低脑内GPIbα和v WF的丰度,抑制P-selectin,MAC-1以及Fibrin(ogen)蛋白的表达。与TRF组相比,ANF不仅缩短出血时间,而且明显减少脑出血。ANF对血小板数量无明显影响。结论:ANF对线栓法所致小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有较好的保护作用,且有效减少脑出血并发症。其机制可能与抑制GPIbα与v WF,P-selectin和MAC-1的结合而阻止血小板的粘附与聚集,减少Fibrin(ogen)的聚积而降低微血栓形成有关。
刘思璐[8]2016年在《流体剪应力下胶原、VWF-A1A2A3介导的血小板P-选择素的表达研究》文中指出在初始的止血反应过程中,血小板通过胶原(collagen)、血管性血友病因子(von Willebrand factor,VWF)的介导黏附到血管受损部位。而这整个过程都是在血流剪应力环境下发生的,通过力-化学偶联的作用进一步激活血小板,血小板活化会在其膜表面表达P-选择素(P-selectin)。P-选择素表达是血小板活化的一个重要标志,在止血反应中发挥了重要作用。成熟的VWF由A、B、C、D四种结构域组成,A结构域是VWF分子的关键结构域,包括A1A2A3叁联体,其中A1和A3结构域分别含有血小板膜受体GPIbα和胶原的结合位点,VWF-A1A2A3相当于是连接血小板与胶原的桥梁。鉴于胶原、VWF-A1A2A3与血小板之间的相互作用在血小板初期止血反应中起着关键性作用,本文以胶原、VWF-A1A2A3与血小板的相互作用作为研究对象,用平行平板流动腔作为实验手段,研究在不同剪应力下胶原、VWF-A1A2A3介导的血小板黏附及血小板P-选择素的表达,从而增强对于在生理条件下的流体剪应力是如何通过胶原、VWF-A1A2A3来介导血小板活化并发挥止血功能的认识。首先,通过探索目的蛋白的表达条件(胶原通过购买得到,而VWF-A1A2A3通过表达得到),使VWF-A1A2A3表达。通过镊柱亲和层析纯化蛋白,用SDS-PAGE和Western-Blot鉴定纯化蛋白的纯度和特异性,蛋白定量结果表明每100m L上清液可纯化得到53.85mg VWF-A1A2A3蛋白。然后,采用流动腔实验检测目的蛋白的生物学活性——介导血小板黏附的能力。将提取的血小板(来源于健康志愿者)以不同的流体剪应力(1~20dyn/cm2)灌注到底板做不同处理(分别铺有1%BSA、PBS、200μg/m L collagen、VWF-A1A2A3和VWF-A1A2A3/collagen混铺)的流动腔中。通过对照实验,证实了血小板与蛋白分子之间的黏附是特异性介导的。从实验结果可知,1%BSA可以有效阻断血小板与底板间的非特异性黏附,而又不影响血小板与蛋白分子间的特异性相互作用,因此,后续实验均采用此方法对流动腔底板进行功能化。最后,仍然采用流动腔作为研究手段,将提取的血小板以低剪应力流经功能化底板(分别铺200μg/m L collagen,VWF-A1A2A3,VWF-A1A2A3/collagen,都含有1%BSA)的流动腔中,孵育10min,使血小板与底板分子充分结合。用0~20dyn/cm2流体壁面剪应力作用不同时间(0min,2,5min,5min,7.5min,10min,12.5min,15min)后,观察分析不同化学兴奋剂介导的血小板表面P-选择素的激活水平。为验证血小板膜表面P-选择素的表达是否具有力依赖性,以及在不同剪应力条件下不同化学兴奋剂对血小板的P-选择素表达水平的影响,我们通过分析激活比率、达峰时间、相对荧光强度等参数来探讨上述问题。结果表明,血小板的激活比率具有力依赖性,流体剪应力调控血小板P-选择素表达速率,不同的化学兴奋剂调控P-选择素达峰时间,VWF-A1A2A3/collagen能更快激活血小板。
杨小芳[9]2013年在《vWF-A1A2A3介导的循环血小板的翻滚运动》文中认为血管受损后，血管内皮下胶原暴露，血液中的假性血友病因子（von Willebrand factor,vWF）会迅速地结合到胶原分子上。结合了的vWF受到血流高剪应力的作用发生构象改变暴露血小板结合位点，从而捕获血液中循环的血小板，使血小板粘附到受损位点。血小板初步粘附是依赖于血小板表面糖蛋白GPIbα与vWF的A1结构域的相互作用。二者相互作用发生异常会导致机体凝血功能紊乱，引起出血性或者血栓性血管疾病。为深化理解血管性疾病的发病机理，本文以起始止血第一步的vWF分子的重要功能结构域A1A2A3叁联体与血小板为研究对象，平行平板流动腔为研究手段，研究流体剪应力如何调控血小板膜分子GPIbα与vWF上的重要功能结构域A1A2A3之间的相互作用，从而推进关于正常生理条件下体内血流剪应力如何经由GPIbα/vWF介导来调控血小板的翻滚黏附、从而使血小板发挥止血功能的认识，并可能有助于对各种功能异常的vWF所导致的血小板凝血功能失常的疾病进一步研究。首先，我们采用脂质体转染方法，将实验室保存的vWF-A1A2A3质粒转染到中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1中进行vWF-A1A2A3的表达，稳定转染后扩大CHO-K1培养，收集CHO-K1培养液Opti-MEM I上清，通过浓缩、透析和亲和层析，纯化出vWF-A1A2A3蛋白。然后，采用流动腔实验技术，将提取纯化的健康志愿者血小板悬浮液在不同的流体剪应力（1~20dyn/cm2）环境下灌注到底板铺有200μg/ml vWF-A1A2A3流动腔中，使血小板的表面糖蛋白GPIbα与vWF-A1A2A3发生相互作用。记录血小板在流动腔中的行为，我们提取翻滚速度，翻滚速度分布，翻滚时间，翻滚时间分布，停留时间，停留频率，停留时间比率等动力学参数。我们发现血小板在vWF-A1A2A3的底板上翻滚的速度、翻滚时间、停留时间、停留频率和停留时间比率等参数均呈现非单调的双相力依赖的特性。血小板GPIbα-vWFA1A2A3相互作用经历了一个转化过程，随着流体剪应力的增大，翻滚速度、翻滚时间和停留频率均随之先减小后增大；而停留时间和停留时间比率趋势则刚好相反，其阈值也在8dyn/cm2左右，与翻滚速度和翻滚时间一致。其中剪应力对翻滚时间的影响不显着。实验结果揭示出血小板GPIbα-vWF-A1A2A3相互作用存在着流动增强型现象。当剪应力阈值水平之下，剪应力的增加可降低细胞滚动速度并增加滚动的稳定性。流体剪应力主要通过调节血小板在vWF-A1A2A3上的停留时间而非翻滚时间来影响其翻滚速度的，提示相应的力学调节机制与GPIbα/A1A2A3相互作用的粘附键从逆锁键向滑移键的转化过程相关。
王广新, 王慧, 刘雪梅[10]2013年在《血小板膜糖蛋白与过敏性紫癜关系的研究进展》文中认为过敏性紫癜是儿童发病率最高的血管炎,其发病机制尚未完全明确。有研究认为,过敏性紫癜患者血小板的聚集功能增强,存在血液的高凝状态甚至有微血栓形成,因此,原本在输血领域发现的血小板膜糖蛋白,被许多研究证实与过敏性紫癜的发生和发展存在一定的联系。本文对血小板膜糖蛋白与过敏性紫癜的关系加以综述,为进一步揭示过敏性紫癜的机制及治疗提供新的思路。
参考文献：
[1]. 重组血小板糖蛋白Ibα对血小板聚集抑制作用的研究[D]. 苏丽. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003
[2]. 抗血小板膜糖蛋白Ibα单克隆抗体的人源化及基于膜糖蛋白Ibα结构的活性小分子化合物研究[D]. 杨剑峰. 苏州大学. 2010
[3]. 抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对血小板功能的影响[D]. 程彦. 第叁军医大学. 2012
[4]. 血小板膜糖蛋白分子生物学特性及其抗血栓研究进展[J]. 申卫东. 内科. 2011
[5]. 瘤源性von Willebrand Factor对肿瘤扩散能力的影响及其受黄芪多糖作用的研究[D]. 杨爱军. 兰州大学. 2018
[6]. 人血小板膜糖蛋白GPIbα(H1-V289)的原核表达及其生物活性研究[J]. 马珍妮, 董宁征, 白霞, 杨剑峰, 谢丽倩. 苏州大学学报(医学版). 2010
[7]. 安菲博肽对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[D]. 李婷婷. 安徽医科大学. 2015
[8]. 流体剪应力下胶原、VWF-A1A2A3介导的血小板P-选择素的表达研究[D]. 刘思璐. 华南理工大学. 2016
[9]. vWF-A1A2A3介导的循环血小板的翻滚运动[D]. 杨小芳. 华南理工大学. 2013
[10]. 血小板膜糖蛋白与过敏性紫癜关系的研究进展[J]. 王广新, 王慧, 刘雪梅. 齐齐哈尔医学院学报. 2013
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