周振宇陈桂秀刘涛
（四川省南充市川北医学院第二临床医学院<南充市中心医院心血管内科>四川南充637000）
【中图分类号】R394【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）48-0011-02
【摘要】目的方法采用组织贴块法和酶消化法相结合的方法原代大鼠血管平滑肌的培养。采用差速贴壁分离法来纯化细胞；通过形态学观察和抗α-平滑肌肌动蛋白细胞免疫荧光法鉴定细胞。结果通过倒置显微镜观察，平滑肌细胞多呈梭形，并相互交织排列而呈现典型的“峰-谷”状生长。细胞传至7-8代时出现细胞老化。抗α-平滑肌肌动蛋白细胞免疫荧光法鉴定细胞高倍镜下可见胞质内大量红色、与细胞长轴平行的α-平滑肌肌动蛋白丝。结论组织贴块法和酶消化法相结合成功进行了血管平滑肌培养，且培养周期短，操作简便。
【关键词】大鼠血管平滑肌细胞细胞培养
血管平滑肌细胞（VSMC）是血管中层的主要细胞成分。在动脉粥样硬化的形成与发展中，血管平滑肌细胞的迁移与增殖起着重要的作用[1]，也与冠状动脉旁路移植术（CABG）后移植血管和经皮冠脉腔内血管成形术（PTCA）术后相关血管病变处再狭窄的发生相关[2]。VSMC的体外培养是进行相关基础研究的基础。本研究参照相关文献[3,4]并改进进行原代VSMC的分离与培养。
1材料与方法
1.1实验动物
200～250g清洁级雄性SD大鼠，购自川北医学院实验动物中心[合格证书号：SCXK（川）2008-18]。室温颗粒饲料喂养，常规饮水。
1.2细胞的分离与培养
大鼠颈椎脱臼致死，放入消毒后的手术台。予75%的酒精消毒皮肤，沿腹中线由膈下剖开至颈部，用眼科镊翻开左侧肺叶，在脊柱左前找到胸主动脉。用眼科镊及眼科剪分离并取出胸主动脉并放入盛有PBS的培养皿中（含100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素），迅速转入细胞培养室的超净工作台。在超净工作台中培养皿内反复冲洗去除血污，用两把眼科镊夹住血管反方向用力剥除外膜，然后转移入另一PBS（含100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素）的细胞培养皿中。用眼科剪剪去血管外的小分支，再转移入盛有含20％FBS的DMEM（含100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素）的细胞培养皿中。剪开血管腔，在血管内膜面上用眼科弯镊轻轻刮除血管内膜层。最后将剪开的血管转移入另一盛有含20％FBS的DMEM（含100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素）的细胞培养皿中，用眼科剪将血管段剪成约l×lmm大小的组织块。用弯头吸管将组织块转入25ml细胞培养瓶中（培养瓶底面预先用培养基浸湿），均匀平铺在培养瓶的底面，组织块的间距约0.5cm，在组织块上滴2-3滴含20％FBS的DMEM（含100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素）。将培养瓶轻轻翻转使瓶底朝上，旋松瓶盖，于培养箱（37℃，5％CO2）内放置3h，待组织块干涸与瓶底贴附后将培养瓶翻转平放，向瓶中加入含20％FBS的DMEM（含100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素）3ml，继续放入培养箱（37℃，5％CO2）内。3天后再向培养瓶中加入含20％FBS的DMEM（含100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素）3ml，继续放入培养箱（37℃，5％CO2）内静置。2天后取出培养瓶，倒置显微镜下观察可见贴壁的组织块周围有少量细胞生长，用吸管将组织块从培养瓶中转移到离心管。离心管离心1500转/分×5分钟，弃去上清液，加入0.25%胰蛋白酶，于37℃水浴10分钟；组织块呈絮状,加入含20％FBS的DMEM终止消化，再次离心离心1500转/分×5分钟，弃去上清液；加入含20％FBS的DMEM到离心管，用吸管吹散后细胞后转入25ml培养瓶放入培养箱（37℃，5％CO2）内继续培养。其后每3天换液1次。
1.3细胞的传代与纯化
待原代培养的细胞达到80-90％融合时进行细胞传代。吸出原培养基后加入5mlPBS，轻轻晃动培养瓶，再将PBS吸出。加入0.25%胰蛋白酶后将培养瓶平放并轻轻晃动，在倒置显微镜下观察，见细胞回缩变圆、细胞团开始有脱落时立即加入含20％FBS的DMEM来终止消化；用吸管均匀吹打,使细胞脱离瓶底而悬浮；将细胞悬液转入离心管，离心1500转/分×5分钟，弃去上清液；加入含20％FBS的DMEM到离心管，用吸管吹散后细胞后将细胞一分为二接种到新的培养瓶中继续培养。
采用差速贴壁分离法来纯化细胞[4]：当细胞传至第2代后,在传代时将细胞悬液静置15分钟，随后用吸管将细胞悬液转移至另一培养瓶中,再次静置,再重复上述步骤2次，最终可以得到较纯的平滑肌细胞。
1.4细胞的鉴定
1.4.1形态学观察：通过倒置显微镜观察细胞的形态和生长状态。
1.4.2细胞免疫荧光：取第3代对数期生长细胞，予0.25%胰蛋白酶液消化后制成单细胞悬液。将细胞接种到24孔细胞培养板中，放入培养箱（37℃，5％CO2）培养，待细胞接近长成单层，予抗α-平滑肌肌动蛋白细胞免疫荧光法鉴定。
2结果
2.1原代细胞的生长情况组织块在培养基中培养5天后，有部分组织块有少量细胞萌出，进行消化后继续培养5-7天即可进行首次传代。通过倒置显微镜观察，平滑肌细胞多呈梭形，并相互交织排列而呈现典型的“峰-谷”状生长，见图2.1。
图2.1大鼠血管平滑肌细胞生长情况（40X）
2.2传代细胞生长情况原代细胞传代后，3天换液1次，培养8-10天细胞再次长成致密单层铺满瓶底时可再次传代。细胞传至7-8代时出现细胞老化，细胞生长缓慢，死亡率高，细胞畸形增多。
2.3大鼠血管平滑肌细胞的免疫荧光鉴定：α-平滑肌肌动蛋白是平滑肌细胞特异性标志因子，存在于胞质中。经罗丹明染色细胞胞质呈红色，高倍镜下可见胞质内大量红色、与细胞长轴平行的纤维细丝，为α-平滑肌肌动蛋白丝，见图2.2。
图2.2细胞免疫荧光检测α-平滑肌肌动蛋白的表达
3讨论
本实验成功分离培养了大鼠血管平滑肌细胞并进行了相关鉴定。目前常用血管平滑肌培养方法有酶消化法和组织贴块法。酶消化法培养周期短，但酶作用时间不易掌握，且消化酶本身对细胞有毒性作用，可致培养失败；组织贴块法虽培养周期相对较长，但操作简便，污染机会小，培养效率高[5]。本实验将2种方法结合，具有如下的优点：1）细胞培养周期短：组织块在培养基中培养5天后消化，继续培养5-7天即可进行首次传代。2）操作简便：在早期的实验中，在将组织剪成小块后按照标准的组织贴块法培养5天后再行消化，最终成功培养出细胞。但在后期的实验中发现，实验的成败与组织块是否能贴壁无关，即将组织块在培养基中浸泡5天后再行消化也能培养出细胞，且多次重复均成功，细胞的培养周期与原方法无差异。
正常动脉血管分为3层：内膜由单层内皮细胞、少量平滑肌细胞及胞外基质构成，中膜层唯一的细胞成分是平滑肌细胞，外膜有成纤维细胞和平滑肌细胞。虽然在取材时去除了胸主动脉的外膜和内膜，但是在原代培养的VSMC仍可有部分的成纤维细胞和内皮细胞混杂生长，需要对培养的细胞进行纯化。细胞的纯化方法一般分为自然纯化和人工纯化。自然纯化的周期较长，很少单独应用。我们利用成纤维细胞和内皮细胞能更快贴壁的特点，采用差速贴壁分离法来纯化细胞。在传代时将细胞悬液静置15分钟,使杂细胞贴壁，随后用吸管将细胞悬液转移至另一培养瓶中,再次静置,再重复上述步骤2次，最终可以得到较纯的平滑肌细胞。
本实验应注意以下几点：1）在制作组织块前，要彻底剥离内膜与外膜，以减少内皮细胞和成纤维细胞的污染。2）胰蛋白酶浓度与消化时间：0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化10分钟是最佳组合，在实验中曾试验不同的胰蛋白酶浓度及消化时间未能成功。3）实验的成败与组织块是否能贴壁无关，即将组织块在培养基中浸泡5天后再行消化也能培养出细胞。
本研究所介绍的细胞培养方法操作简单，培养效率高，可为心血管疾病的基础研究提供理想的实验材料。
参考文献
[1]SchoenFJ.Bloodvessels.Pathologicbasisofdisease.7thed.In:KumarV,AbbasAK,FaustoN,editors[J].Philadelphia:ElsevierSaunders;2005.p.511-54.
[2]CaryLA,GuanJ.Focaladhesionkinaseinintegrin-mediatedsignaling.FrontBiosci,1999,4:102-133.
[3]闫纯英,杨敏,陈畅等.大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定[J].中西医结合心脑血管病杂志,2009V01.7No.10:1190-1191.
[4]郭悦劼,蔡正旭,雷阳,等.大鼠脑动脉平滑肌细胞的体外培养与鉴定[J].中风与神经疾病杂志,2010,27(7):625-627.
[5]梁若斯，陈德．成人动脉平滑肌细胞体外培养模型的建立[J]．中国现代医学杂志．2002，12(10)：31．