野油菜黄单胞菌β半乳糖苷酶缺失菌株的构建及双组分系统RavA/RavR调控鞭毛合成通路的初步研究

论文摘要

野油菜黄单胞杆菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc）是一种重要的植物病原菌,能侵染几乎所有的十字花科植物,但目前还缺乏有效的防治方法。因此了解该细菌致病过程中的信号转导将有利于发展新型的抗病或防病策略与手段。在Xcc中广泛使用的报告基因系统是β-葡萄糖醛酸酶,但此方法费时费力,价格昂贵且无法在平板上直接检测。而β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase,LacZ）作为报告基因是一种简单快速,低成本,稳定的可探测方法。本实验希望利用LacZ的这种功能,用于研究Xcc启动子活性。但Xcc野生型菌株具有LacZ活性,不能直接利用lacZ作为报告基因进行表达分析。为此需要创建一个不具有LacZ活性的菌株用于后续研究。在原核生物中,双组分系统是大多数原核生物的感应-响应信号装置,是微生物生理代谢的主要调控系统。前期研究发现,Xcc中RavA/RavR构成一对双组分系统,RavR属于GGDEF-EAL蛋白家族,是一个双功能酶,既能合成也能分解C-di-GMP,而RavA作为RavR的配对组氨酸激酶起作用,调控RavR的磷酸化水平,决定其酶活性转换。本研究旨在利用lacZ作为报告基因分析Xcc中RavA/RavR对下游鞭毛运动相关基因表达的调控,探索C-di-GMP调控细菌运动的机制。主要研究结果如下:（1）通过生物信息学分析推测Xcc里有2个蛋白家族GH2、GH35可能具有半乳苷酶酶活性,其中5个基因编码GH2蛋白,3个基因编码GH35蛋白。（2）三亲接合基因敲除法构建GH2、GH35缺失突变体,发现当敲除掉8个基因的突变体△lac8时,半乳糖苷酶活性完全丧失。致病力检测发现△lac8致病性与野生型相比没有明显差异,最后通过互补及LacZ酶活检测确定了 XC1214为Xcc主要的半乳糖苷酶。（3）在△lac8中构建ravA、ravR突变体,甘蓝接种试验发现△ravA、△ravR的致病性比野生型低。为解析突变菌株致病力下降的原因及LacZ是否影响相关致病因子的表达,我们分析了一些致病性因子,如胞外酶、胞外多糖、运动性等。生化及表型检测结果表明突变体△ravA △ravR的胞外多糖产量降低,降解淀粉、纤维素的能力不变,细胞运动能力显著减弱。（4）为分析突变体运动力下降的原因,检测了突变体中鞭毛合成相关基因的表达情况。构建了启动子-报告基因融合菌株△ravA-XC2245-lacZ、△ravA-XC2408-lacZ、△ravR-XC2245-lacZ、△ravR-XC2408-lacZ、wt-XC2245-lacZ、wt-XC2408-lacZ。通过 LacZ 活性分析发现 △ravR-XC2245-lacZ、△ravA-XC2245-lacZ 菌株相较于野生型LacZ活性显著增强,说明RavR、RavA缺失降低了鞭毛相关基因的表达。综上所述,本研究构建了Xcc半乳糖苷酶功能缺失突变体,并利用lacZ作为报告基因,通过检测启动子活性进一步分析了Xcc双组分系统中RavR、RavA对下游鞭毛基因（XC2245）表达的调控作用,发现RavR、RavA通过影响细菌的运动性进而影响Xcc的致病力;构建了 Xcc 8004-pUT18C基因组文库并进行了初步的分析。对进一步探索RavR、RavA介导的C-di-GMP调控细菌运动的分子机制和信号网络,提供了前期的基础研究和简单高效的新方法。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王慧琦

导师: 陶均

关键词: 野油菜黄单胞菌,半乳糖苷酶,双组分调控系统,鞭毛合成

来源: 海南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,植物保护

单位: 海南大学

基金: 海南大学青年科学基金(hdkyxj201701),海南省自然科学基金(20163049和20163050),农业部公益性行业科研专项(201403075)

分类号: S432.4

DOI: 10.27073/d.cnki.ghadu.2019.000661

总页数: 56

文件大小: 4282K

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