猪瘟病毒E2蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达、纯化及性质鉴定

论文摘要

经典猪瘟（classical swine fever,CSF）是由世界动物卫生组织（OIE）列出的猪中非常严重而且高度传染的猪类疾病。在我国,因感染CSFV死亡的猪占全部疫病致死猪的三分之一以上,造成大量的经济损失以及巨大的人力和资源的浪费。我国通常使用接种猪瘟弱毒疫苗的方法来预防猪瘟,降低发病率和死亡率,这些疫苗具有突出的安全性和疗效,但是缺乏从已接种动物中区分感染的能力。近年来,猪瘟的疫情由大范围的感染转变为地方性的爆发,疫苗免疫次数的增多和免疫剂量的加大,并不能按照预期有效而及时地控制住猪瘟的蔓延。此外,由于兔化弱毒苗的大量使用以及野毒株产生的变异,疫情出现慢性、隐性感染,以致疫情难以控制。因此,研发出能够快速诊断、安全、高效的新型亚单位疫苗是全世界养猪业的行业需求。为制备具有免疫原性的猪瘟病毒E2蛋白,本研究应用昆虫杆状病毒表达系统表达E2蛋白,随后进行E2蛋白的纯化、免疫原性分析以及糖基化水平的分析。研究中首先将E2基因插入载体pFastBacl,构建重组质粒pFastBac-E2。随后将重组质粒转化至DH10 Bac感受态细胞中发生特异性转座,从而得到重组穿梭载体（bacmid）,提取bacmid并转染昆虫细胞sf21,收获杆状病毒并进行扩增,最终利用病毒感染sf21细胞,从而得到昆虫细胞表达的重组E2蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,结果表明本试验成功表达出重组的E2蛋白。在E2蛋白初步表达的基础上,分别进行CSFV E2蛋白的胞内表达和分泌表达,利用SDS-PAGE及猪瘟抗体检测试纸条分析蛋白表达水平,结果表明E2蛋白的分泌表达量高于胞内表达。进一步进行分泌表达条件的优化,通过对细胞密度、接毒量和接毒时间的摸索,最终确定蛋白表达最佳条件。随后通过金属镍填料纯化E2蛋白,并用分子筛进一步纯化,最终得到纯度较高的E2蛋白,1L细胞培养液可纯化得到27 mg的E2蛋白。利用SDS-PAGE分析纯化效果,结果表明纯化所得E2蛋白纯度较高,约达到90%～97%。将纯化后的E2蛋白添加弗氏佐剂乳化后免疫BALB/C小鼠,采集血清进行CSFV抗体ELISA检测试验,结果显示,免疫后3周血清样本阻断率大于40%,表明小鼠体内产生了较高水平的CSFV抗体,从而证明E2蛋白免疫原性良好。本实验表达了两种具有去糖基化作用的N—糖酰胺酶F（PNGase F）及β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶-F1（Endo-F1）,利用纯化所得的这两种酶处理本研究表达所得重组CSFV E2蛋白,结果表明利用大肠杆菌表达系统得到的PNGase F和Endo F1具有高效的去糖基化作用,且杆状病毒表达所得CSFVE2蛋白糖基化水平较高。综上,本研究成功利用昆虫杆状病毒表达系统表达了可溶性E2蛋白,通过优化表达条件提高其分泌表达水平,最终纯化得到纯度较高的E2蛋白,其糖基化水平较高,免疫原性良好,从而为CSFV亚单位疫苗的研制奠定了基础。

论文目录

致谢

中文摘要

第一部分文献综述

1. 猪瘟研究进展

1.1 猪瘟病毒的分布及分类

1.2 猪瘟病毒的概述

1.3 猪瘟病毒流行病学特征

1.4 猪瘟病毒的诊断和检测

2. 猪瘟疫苗的研究进展

2.1 传统猪瘟疫苗

2.2 研发中的猪瘟疫苗

第二部分研究内容

第一章 CSFV E2蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达及蛋白表达条件的优化

1. 引言

2. 材料与方法

2.1 基因、菌株及载体

2.2 主要试剂

2.3 主要设备及仪器

2.4 培养基和主要溶液的配置

2.5 CSFV E2重组蛋白昆虫杆状病毒表达载体构建

2.6 重组杆状病毒的获得

2.7 E2蛋白的胞内表达及结果分析

2.8 E2蛋白的分泌表达及结果分析

2.9 重组蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中表达条件的优化

3. 试验结果

3.1 CSFV E2蛋白胞内表达和分泌表达结果的对比

3.2 CSFV E2蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中表达条件的优化

4. 总结与讨论

第二章 CSFV E2蛋白的纯化与免疫原性分析

1. 引言

2. 材料与方法

2.1 主要仪器设备

2.2 主要试剂及相关试剂配制

2.3 主要试验动物

2.4 CSFV E2蛋白纯化条件的摸索

2.5 NanoDrop分光光度计检测E2蛋白浓度

2.6 动物免疫方案

2.7 阻断ELISA分析小鼠血清中抗体水平

3. 试验结果

3.1 CSFV E2蛋白纯化条件的确定

3.2 CSFV E2蛋白表达量的确定

3.3 E2蛋白免疫原性评价

4. 总结与讨论

第三章 CSFV E2蛋白糖基化水平的鉴定

1.引言

2. 材料与方法

2.1 菌株

2.2 主要试剂

2.3 主要设备及仪器

2.4 培养基和主要溶液的配置

2.5 去糖基化蛋白PNGase F和Endo F1表达载体的构建

2.6 去糖基化蛋白PNGase F和Endo F1的诱导表达及纯化

2.7 PNGase F对CSFV E2蛋白的去糖基化作用

2.8 Endo F1对CSFV E2蛋白的去糖基化作用

3. 试验结果

3.1 去糖基化蛋白PNGase F和Endo F1表达载体的构建

3.2 去糖基化酶PNGase F和Endo F1的表达和纯化

3.3 PNGase F对CSFV E2蛋白的去糖基化作用

3.4 Endo-F1对CSFV E2蛋白去糖基化作用

4. 总结与讨论

全文总结

参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 余纬

导师: 张改平

关键词: 猪瘟病毒,蛋白,杆状病毒表达系统,蛋白纯化,免疫原性,糖基化

来源: 河南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河南农业大学

分类号: S852.651

DOI: 10.27117/d.cnki.ghenu.2019.000447

总页数: 47

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猪瘟病毒E2蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达、纯化及性质鉴定

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