大肠杆菌鞭毛马达的动力学研究

论文摘要

细菌对地球环境和人类生活有着至关重要的影响。作为最简单的生物体系,大肠杆菌是一类寄生在人体肠道中的单细胞生物,常作为实验室研究的模式生物。大肠杆菌的运动能力是其生存,趋化行为和致病性的重要条件之一,而与运动性密切相关的是细菌鞭毛马达,它是一种精细的分子旋转马达,其分子结构和运动机制都不同于宏观马达。研究细菌运动和马达的运行机理,有着潜在的医学和纳米工程等方面的应用前景,比如在人体中定点输运药物,设计超灵敏的生物传感器和微型机器人等。本论文就大肠杆菌鞭毛马达的动力学过程展开研究,利用乳胶小球标记马达技术和光质子泵（变形菌视紫红质蛋白）控制细菌质子电化学势的技术,结合随机过程模拟,主要研究了鞭毛马达定子的动态交换过程,定子数目与转向偏向率的关系和转向驻留时间分布情况等问题,使我们对鞭毛马达有了进一步的认识和理解。第一章首先介绍了大肠杆菌的背景知识,包括细菌的细胞形态和基本结构,运动性和趋化网络系统,还重点就大肠杆菌鞭毛马达的研究进展作了阐述,接着简单介绍了变形菌视紫红质蛋白的原理和应用,最后分析了研究大肠杆菌的意义和有待解决的问题。第二章介绍了培养细菌的实验方法,主要包括培养的条件,相关试剂的配制,和菌种改造过程中运用的质粒转化技术和重组DNA技术。大肠杆菌的鞭毛马达是动态的,定子会随机地结合或脱离马达。最近的实验表明定子的稳定性与外界负载有关,负载越大时,定子与马达结合的越稳定。在高负载时稳定马达的旋转速度会呈现出阶梯式的波动,我们使用高时间分辨率的相机记录单个马达的速度时间序列,通过分析定子结合在马达上的驻留时间分布情况发现其呈现出双指数分布,这与之前认为定子与马达作用的两态模型相悖,而是存在第三种状态.我们称为隐态（hidden state）。马达定子处在隐态的时间很短,且最多只有一个。相同的方法也可以用来探究其他快速变化的动力学过程。大肠杆菌马达的运动存在两种状态:顺时针旋转（clockwise;CW）和逆时针旋转（counter clockwise;CCW）。马达处在顺时针或逆时针方向旋转的驻留时间分布是反映马达转向动力学的重要特征,我们系统地分析了在不同负载,不同质子驱动力,不同定子数下的驻留时间分布情况,发现随着力矩的增大,驻留时间分布从指数分布向非指数分布过渡。我们将力矩引起的非平衡因素引入构象传递模型中,成功解释了这一现象,并预测出随着外部负载的增加,马达剂量响应曲线会向左移动。马达中仅有大约0.2%的能量输入用于转向调控,但很大程度上提高了马达对信号蛋白CheY-P响应的灵敏度。细菌的转向状态不仅受细胞内趋化网络系统的调控,还与外部负载,温度,质子电化学势（proton motive force;PMF）等因素有关。我们利用变形菌视紫红质蛋白的光质子泵功能,通过不同强度的绿光来调控细菌鞭毛马达的PMF水平,实现细菌的复活过程。在此基础上,研究细胞内不同的CheY-P水平下,CW bias（顺时针转向偏向率）与定子数目的定量关系。由此发现当CheY-P浓度较低时,CW bias随着定子数目的增加从零开始增加;当CheY-P浓度较高时,随着定子数目的增加,CW bias从1开始减小。这表明不同定子数的马达对CheY-P浓度的灵敏度不同,由马达剂量响应曲线可以看出,随着定子数目的增加,希尔系数先减小后增加。这可能是由于力矩的非平衡效应引起的,但具体的机制还有待进一步探究。我们发现在乳胶小球标记细菌鞭毛马达的实验中,马达顺时针和逆时针旋转的状态会出现观测与实际反转的现象,它会直接影响关于探究马达CW bias分布的实验结果。我们猜想是由于鞭毛钩很软,标记乳胶小球后导致其弯曲造成的,但仍需具体的实验来验证这一猜想。我们系统地研究了如何在实验中减小和消除出错概率。实验采集时选取胞体完全粘在玻璃片上,且标记在位于胞体中间位置马达的小球,以此减小出错概率。如要消除出错概率,对于趋化网络完整的细菌,可以通过加入吸引物致使CW bias变小的性质来判断,但当趋化网络被破坏时,我们可以通入PH等于5.0的运动缓冲液导致CW bias变大的趋势来进行判断,从而有效的分辨出细菌真实的运动状态。最后一章我们对本论文的工作做了总结,并对鞭毛马达的未来研究做了展望。

论文目录

文章来源

类型: 博士论文

作者: 史慧

导师: 袁军华

关键词: 鞭毛马达,质子驱动力,复活,趋化网络,非平衡因素,构象传递模型

来源: 中国科学技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国科学技术大学

分类号: Q934

总页数: 118

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