宋丽[1]2003年在《多枝赖草逆境胁迫应答基因的分离与鉴定》文中研究表明土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的严重问题，随着工业污染加剧，灌溉用水的质量不断下降和化肥使用不当等原因，次生盐碱化土壤面积有不断加剧的趋势，给农业生产造成重大损失；黄矮病毒病是小麦等禾本科植物的重要病害之一，其传毒介体蚜虫更使植物产量损失巨大。因此，植物耐盐、耐黄矮病、耐蚜虫等机理和相应耐性植物的培育，乃至相应耐性相天基因的分离与克隆及其基因工程育种的研究正在受到人们越来越多的关注。我国新疆重要天然草种多枝赖草，分布于盐渍化荒漠草甸，目前已被证实具有突出的耐干旱、耐盐碱、耐黄矮病、耐蚜虫、耐瘠薄、耐污染等优异抗逆特性。这些特性都是目前种植的大多数农作物、牧草与草坪草栽培品种，本身缺乏急需改良的特性。因此，分离克隆控制这些优异抗逆特性的功能基因，非常必要。 本研究就是利用近年来发展起来的DDRT-PCR技术，研究了高度耐黄矮病耐蚜虫的二体异附加系Line24及其感病虫小麦亲本‘中国春’、‘丰抗13’在接种带有大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus，简称BYDV)GAV株系的蚜虫、不带有BYDV-GAV株系的蚜虫及不接蚜虫叁种处理下不同时期基因表达的差异；亦研究了高度耐盐的小麦-多枝赖草二体异附加系Line14及其敏盐小麦亲本‘中国春’、‘丰抗10’在盐胁迫和非盐胁迫下不同时期基因表达的差异。采用3条锚定引物和8条随机引物共计24种组合，获得了6480条耐病材料cDNA扩增条带，其中91.8％在不同处理条件下是非常一致的。在表现差异的条带中，共分离得到了12条Line24特异表达条带，其中8条是有毒蚜诱导下的带，3条是有毒蚜、无毒蚜和不接蚜虫处理下均表达的带，1条是有毒蚜和无毒蚜处理下均表达的带；也获得10800条耐盐材料cDNA扩增条带，其中89.5％在不同处理条件下是非常一致的。在表现差异的条带中，共分离得到了14条盐胁迫诱导下Line14特异表达条带，其中12条筹异带在6h的材料中获得，2条在6h，24h，48h中均有表达。选择8条Line24利9条Line14的特异表达条带进行克隆与测序，在Genbank中进行blast比较后，有的条带与小麦中已知片段具有高度同源性，选取6条与genebank中的EST序列相关性较小的片段，进行 宋丽:多枝赖草逆境胁迫应答基因的分离与鉴定Northem杂交验证，结果耐病NB14片段与所有感病虫小麦亲本均无杂交信号，而与耐病虫材料Line24有阳性杂交信号;耐盐NY13片段与所有敏盐小麦亲本均无杂交信号，而与耐盐材料Line14及其耐盐亲本多枝赖草均有阳性杂交信号，说明NY13片段确实是多枝赖草特有的与盐胁迫应答基因相关的EST。继续用NY13片段为探针，进行Southern杂交分析，结果只与多枝赖草有杂交信号，且信号强，进一步证实该EST是多枝赖草总基因组DNA本身所具有的特异序列，杂交片段本身很可能是多枝赖草六侧协迫应答新基因之一或其 一部分。继续回收杂交信号处的ONA片段，连接到可转化人l_染色体(TAC)载体上，构建成含有多枝赖草盐胁迫应答基因的TAC克隆，以期今后通过耐盐功能互补实验验证而直接用于基因_「程育种，井可进一步筛选分离获得耐盐相关基因。
赵茂林, 张敬原, 宋丽, 沈银柱, 黄占景[2]2003年在《多枝赖草逆境胁迫应答基因的分离与鉴定》文中研究说明多枝赖草(Leymus multicaulis,2n=4X=28,XmXmNsNs)是我国新疆重要天然草种,分布于盐渍化荒漠草甸,目前已被证实具有突出的耐干旱、耐盐碱、耐黄矮病、耐蚜虫、耐瘠薄、耐污染等优异抗逆特性。这些特性都是目前种植的大多数农作物、牧草与草坪草栽培品种,本身缺乏急需改良的特性。因此,分离克隆控制这些优异抗逆特性的功能基因,非常必要。我们利用近年来发展起来的差异显示反转录聚合酶链式反应(DDRT-PCR)技术,研究了高度耐黄矮病耐蚜
史仁玖[3]2005年在《多枝赖草（Leymus multicaulis）盐胁迫应答相关基因的克隆及表达分析》文中研究指明多枝赖草(Leymus mul ticaulis＜Kar1 & Kir1＞Tzvel 1，2n=4X=28，XmXmNsNs)属于小麦近缘属赖草属，分布于欧亚地区不同的生态环境下，我国主要分布于新疆地区，生长于平原绿洲和盐渍化荒漠草甸，具有突出的耐瘠薄、耐盐碱性、耐寒性等特性。开展多枝赖草抗逆分子生物学研究，分离耐盐相关基因，对于农作物的耐盐育种具有重要意义。本研究以盐胁迫下的多枝赖草叶片为材料，改良了多枝赖草叶片总RNA提取方法，建立了适合多枝赖草的mRNA差异显示体系，分离与分析耐盐相关基因cDNA序列，克隆谷胱甘肽还原酶基因。结果如下： 采用四种方法提取多枝赖草叶片总RNA(异硫氰酸胍法、SDS法、CTAB法和TRIZOL试剂快速提取法)，结果表明：TRIZOL提取法提取的RNA产量较低，电泳呈现出28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA叁条清晰的条带，A_(260)／A_(280)为1.845，A_(260)／A_(230)为2.091，表明RNA的纯度很高。而另外叁种方法获得的RNA纯度低，有降解现象。用TRIZOL法提取的RNA作为模板，可以扩增出组成型Actin基因片段，表明提取的多枝赖草叶片总RNA能够满足分子生物学研究需要。 通过对退火温度、模板用量、Taq酶和Mg~(2+)浓度的优化，建立了适合多枝赖草基因差异显示的DDRT-PCR体系。选用26个随机引物，分别与3个锚定引物组合成引物对，进行盐胁迫下多枝赖草mRNA差异显示，获得17个长度在300～600bp的差异cDNA条带，进行序列测定及分析。反Northern杂交分析筛选出11个阳性片段。 GenBank／BLAST分析，DNA片段1编码的蛋白与腺苷酸结合蛋白有29％的相似，这与DNA的表达调节有关；cDNA片段2编码的蛋白质与与UMP／CMP kinase 42％相似，UMP／CMP kinase与核苷酸的磷酸化有关，在信号传导方面起作用cDNA片段4编码的蛋白质与S9蛋白有49％的相似性，S9蛋白具有清除活性氧的功能，而活性氧是各种水分胁迫的主要伤害
徐粤宇[4]2007年在《多枝赖草基因组可转化人工染色体（TAC）文库的构建、鉴定和筛选》文中认为多枝赖草(Leymus multicaulis)(2n=4x=28=14Ⅱ，XmNs)是禾本科小麦族大麦亚族赖草属小粒种子类型的一个种，是我国新疆重要天然牧草，它分布于盐渍化荒漠草甸，目前已被证实具有突出的耐干旱、耐盐碱、耐黄矮病、耐蚜虫、耐瘠薄、耐污染等优异抗逆特性。这些特性都是目前种植的大多数农作物、牧草与草坪草栽培品种，本身缺乏急需改良的特性。出于主要在我国分布，国外对其利用的研究较少。因此，分离克隆控制这些优异抗逆特性的功能基因是非常必要的。植物可转化人工染色体(TAC)载体结合了PAC载体和双元载体的优点，含P1质粒和Ri质粒的复制子，能在大肠杆菌(Escherichia coli)和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中以单拷贝形式复制，一旦筛选到目标阳性克隆，不需要做繁琐并有可能导致目标基因丢失的亚克隆工作，不需要重新构建转化载体，可直接利用农杆菌转化系统将其转到植物体中进行基因功能互补实验，从而加速目的基因的实用化进程。为了克隆和转化多枝赖草的优异抗逆性基因，以多枝赖草叶为材料提取细胞核，经钢丝细胞筛过滤，多次回收滤渣和离心上清中的细胞核，相差显微镜调浓度达10~8个／mL后，经LMP包埋，蛋白酶K降解核蛋白，脉冲电泳纯化回收后，在LMP凝胶中纯化2Mb以上DNA，经HindⅢ部分酶切再用脉冲电泳回收不同大小范围的DNA，电洗脱浓缩除盐，与TAC载体连接后电转化导入细菌DH10B，在卡那霉素和蔗糖选择压下筛选阳性克隆。用两种TAC载体pYLTAC17和pYLTAC747H分别构建了文库Ⅰ和Ⅱ，约16.5和23.6万个克隆，插入片段长度为9kb～300kb，估计覆盖3～5倍多枝赖草基因组大小。文库以混合克隆形式保存在12×2块深孔96孔板中，每孔1.2mL菌液中平均约含500个克隆；同时从文库Ⅰ和Ⅱ分别挑取2501和2890个单克隆存于14块384孔板中。为了后续文库鉴定，将12块深孔96孔板中的40多万个混合克隆转存到3块384孔板中，连同14块单克隆384孔板都用GeneTAC~(TM) G3复制了2份，点高密度杂交膜6张。以多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因5′RACE-GR和3′RACE-GR为探针初步筛选到19个阳性克隆；同时还以6个多枝赖草抗逆相关EST序列，在GenBank、EMBL和DDBJ叁大核酸数据库中进行比对延伸，均得到了相应电子克隆序列，各设计3对引物，准备用PCR-Pool法对文库Ⅰ和Ⅱ进行全面的筛选。为多枝赖草抗性基因的克隆、物理图谱的构建、功能验证等基因组有关研究奠定了基础。
郭慧娟[5]2012年在《普通小麦中盐胁迫诱导表达基因的鉴定》文中研究指明盐碱胁迫是环境胁迫的一种，由于该胁迫的普遍存在性，以及近年来土壤盐渍化不断加剧的情况，而成为限制农作物产量的主要因素之一。大量研究表明，盐碱胁迫降低了植株的干鲜重、减少了其叶面积、根系活力、相对生长量等指标，从而导致其产量的下降，因此提高作物的耐盐特性、培育耐盐品种，是现阶段育种工作者的重要目标。小麦是产量仅次于玉米的世界第二大粮食作物，同时也是一种淡土作物，其耐盐特性的研究对世界农业发展具有举足轻重的意义。本研究中首先对不同小麦品种（系）的耐盐生理指标进行测量，然后通过表达谱分析，进行耐盐相关基因的筛选和鉴定，并对SAMS基因进行了较深层次的研究，为了解普通小麦的耐盐机制提供了技术支持和理论依据。1.盐胁迫下不同小麦品种（系）的生理指标，能够有效的反应材料的耐盐特性。本研究测定了搜集到的19个小麦品种（系），在盐处理下种子的萌发率、幼苗的电导率、根长、苗长、干重、鲜重等生理指标，根据测定结果又结合材料的亲缘关系，选定了6个材料用于进一步的研究分析。2.对选定的6个小麦材料，在水培条件下进行盐胁迫处理，然后分别测定每个材料的地上部分和地下部分组织中的Na+和K+的含量，通过分析发现，所选定的4个耐盐材料有叁种不同的耐盐机制。表明了所选定的小麦材料具有很好的代表性，是研究普通小麦耐盐特性的合适材料。3.采用cDNA-AFLP的方法，在转录组水平上筛选多枝赖草与小麦的二体附加系Line15的盐胁迫诱导表达基因。本研究中用了76对多态性良好的引物，挑出差异片段TDF132条，经测序分析发现有78个基因在植物的数据库中存在同源序列，而对功能的分析表明，其中15个基因已被前人在不同物种中研究证明与盐胁迫相关。4.采用荧光定量Real Time-PCR技术，对筛选得到的腺苷甲硫氨酸合成酶基因SAMS，进行盐胁迫处理不同时间段的表达方式验证。研究表明，SAMS基因在盐胁迫处理24h时在六个材料中均有较大幅度的提升，而在材料Line15中的表达量尤其高。这表明了对Line15中SAMS基因的研究，对小麦和多枝赖草二体附加系材料的耐盐机制的探索，具有重要的意义。5.通过生物信息学分析和克隆测序相结合的方法，分别设计SAMS基因的保守引物和特异引物，从而鉴定出在普通六倍体小麦中国春中，SAMS基因有六个拷贝，并且定位在了第六群的A组、B组和D组染色体上。该结果为进一步研究SAMS基因的功能等详细信息奠定了基础。
参考文献：
[1]. 多枝赖草逆境胁迫应答基因的分离与鉴定[D]. 宋丽. 河北师范大学. 2003
[2]. 多枝赖草逆境胁迫应答基因的分离与鉴定[C]. 赵茂林, 张敬原, 宋丽, 沈银柱, 黄占景. 中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编. 2003
[3]. 多枝赖草（Leymus multicaulis）盐胁迫应答相关基因的克隆及表达分析[D]. 史仁玖. 南京农业大学. 2005
[4]. 多枝赖草基因组可转化人工染色体（TAC）文库的构建、鉴定和筛选[D]. 徐粤宇. 首都师范大学. 2007
[5]. 普通小麦中盐胁迫诱导表达基因的鉴定[D]. 郭慧娟. 河南农业大学. 2012