核盘菌DNA病毒SsHADV-1的基因功能和入侵机制研究

论文摘要

核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）是一种寄主范围广,危害严重的植物病原真菌,引致的菌核病对我国油料作物的生产造成了严重影响。可以引起核盘菌致病力衰退的病毒,是防治菌核病的重要生防资源。核盘菌低毒相关DNA病毒SsHADV-1（Sclerotinia sclerotiorum hypovirulence associated DNA virus 1）可以突破寄主营养体不亲和性限制进行水平传播,具有体外传播方式等特性,生防潜力相比于其他报道病毒优势明显。本论文以核盘菌和SsHADV-1为互作系统,探讨了SsHADV-1的基因功能、病毒直接侵染菌丝机制及核盘菌抗病毒的机理。初步探讨了病毒SsHADV-1的衣壳蛋白Cp和复制相关蛋白Rep在核盘菌中的生物学功能。利用真菌启动子PtrpC或EF-1α,获得了在核盘菌菌株Ep-1PNA367中超量表达Cp和Rep基因的转化子。两种类型的转化子中病毒的Cp和Rep基因可以单独或共同转录,但是均检测不到病毒蛋白翻译。阳性转化子在菌丝尖端形态、菌落形态、及产酸能力和致病力上均与菌株Ep-1PNA367不存在显著性差异。此外,SsHADV-1病毒能通过菌丝融合自携带病毒的核盘菌水平传播至表达Cp和Rep转化子中,据此推测病毒Cp或Rep在核盘菌中超表达均不能抗病毒。利用SsHADV-1外壳蛋白Cp单克隆抗体对携带病毒菌株的总蛋白进行免疫沉淀反应,获得核盘菌中61个与病毒Cp互作的候选蛋白。分析了SsHADV-1病毒粒子直接进入核盘菌菌丝的分子机制。通过高通量测序在转录水平上分析了病毒粒子侵染菌丝早期（1 h-3 h）的核盘菌差异表达基因,发现在核盘菌菌丝受SsHADV-1病毒粒子侵染后,共有187个基因显著差异表达,其中114个上调表达,73个下调表达。受病毒粒子侵染的差异表达基因主要参与到生物代谢、抗生素和次级代谢产物合成途径。细胞结构分析表明有26%的差异基因与膜结构相关,且10个基因被预测定位于细胞膜上。30%有功能注释的基因预测参与Ras-small G蛋白信号转导途径。因此,推测SsHADV-1病毒粒子在侵染初期可能结合宿主膜蛋白,并在感染过程中通过Ras-small G蛋白偶联受体进行信号转导。明确了受病毒SsHADV-1侵染影响的核盘菌基因SS1G06180生物学功能。利用SsHADV-1病毒粒子直接侵染核盘菌Ep-1PNA367的菌丝,处理3 h时基因SS1G06180显著下调表达。SS1G06180全长1498 bp,在核盘菌中功能未知,预测编码一种蛋白激酶,且含有多个phos-PKC类型磷酸化位点。该假定蛋白在5’端编码含有Macoilin家族蛋白的跨膜结构,此外含有编码Pal1的保守结构域,预测定位于细胞核内。通过病毒水平传播,证明沉默基因SS1G06180的转化子具有抗DNA,+ssRNA和dsRNA真菌病毒的特性,与典型的RNAi和甲基化抗病毒机制不相同。分析沉默基因SS1G06180的转化子转录组测序结果,发现沉默转化子中酪氨酸和苯丙氨酸代谢、次级代谢产物合成和甘油酯代谢等通路受到影响。野生型核盘菌在PDA上生长第5 d（菌核原基形成）和第9 d（菌核成熟）时,SS1G06180表达量较高。获得了敲除SS1G06180的转化子,其表型为菌落较白,菌核数量减少,单个菌核增大,致病力下降。黑色素与菌核形成相关,在敲除转化子中黑色素合成信号通路的聚酮合酶基因PKS13明显下调表达,小柱孢酮脱水酶基因SCD1和还原酶基因T4HN显著上调表达,推测SS1G06180在核盘菌中参与黑色素合成从而影响菌核发育。前期的研究发现SsHADV-1不能感染灰葡萄孢,但是本研究表明SsHADV-1病毒粒子虽然不能直接侵染灰葡萄孢健康菌丝,但是病毒粒子可以通过PEG介导感染3个不同的灰葡萄孢菌株,且病毒可以在灰葡萄孢菌丝中复制和增殖。获得病毒SsHADV-1后的灰葡萄孢菌株B05.10-HADV平均生长速度为11 mm/d,显著低于不含病毒的灰葡萄孢B05.10（平均生长速度为14 mm/d）。菌株B05.10-HADV菌落异常,其分生孢子携带病毒SsHADV-1的概率为1/20。从菌株B05.10-HADV中提取的DNA病毒粒子裂解获得的病毒核酸与SsHADV-1有一个碱基的差别,在编码病毒Rep的2086位碱基由C（胞嘧啶）碱基突变为T（胸腺嘧啶）碱基,对应的氨基酸则由苏氨酸突变为丝氨酸。推测SsHADV-1的Rep区域单碱基突变可能造成了寄主范围的改变。研究了表达SsHADV-1病毒的拟南芥对核盘菌的抗性。将连接有1个和1.6个SsHADV-1病毒单位长度的侵染性克隆载体,转化野生型拟南芥,发现病毒的基因组可以整合到拟南芥中,转基因效率超过68.5%。但转基因拟南芥中不能形成游离的病毒核酸,同时western-blot检测不到SsHADV-1衣壳蛋白的表达。不含病毒的强毒力核盘菌可以侵染转病毒拟南芥,并造成整株转基因苗死亡。本研究初步建立了DNA病毒SsHADV-1和核盘菌的互作体系,为寻找病毒低毒机理和生产应用提供了重要线索和指导意义。

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文章来源

类型: 博士论文

作者: 丁峰

导师: 姜道宏

关键词: 核盘菌,免疫沉淀,转录组,侵染初期,抗病毒,黑色素

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,植物保护,植物保护

单位: 华中农业大学

基金: 国家自然科学基金31430070,国家重点研发计划2017YFD0201100,中国农业研究系统专项资金CAS-13

分类号: S432.44;S476

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000160

总页数: 181

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标签：核盘菌论文;  免疫沉淀论文;  转录组论文;  侵染初期论文;  抗病毒论文;  黑色素论文;