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抗PEDV单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

2020-12-08阅读(694)

抗PEDV单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

论文摘要

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）感染猪引起的肠道传染性疾病。患病仔猪主要临床特征为呕吐,腹泻,严重脱水等症状。近几年该病在我国的流行范围明显扩大,病原致病性亦有增强趋势,是当前仔猪腹泻死亡的重要病因之一。临床表现上,猪流行性腹泻与其他猪病毒性腹泻病临床症状上极为相似,因此,需要进行实验室鉴别诊断。其中ELISA特异性强,灵敏度高,可批量化检测,对本病病原检测具有重要价值。为获得ELISA主要检测试剂,本研究制备了抗PEDV单克隆抗体。以Vero细胞繁殖PEDV,将病毒培养物梯度密度离心纯化后,免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、克隆和多次筛选获得了三株稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为43B6-H2,75E2-F3,27C9-C5-D8。三株单克隆抗体经亚型鉴定均为Ig M亚型;间接ELISA测定杂交瘤细胞上清液抗体效价分别为1:6400;1:3200;1:3200;Western blot结果显示,三株单克隆抗体均能特异性与PEDV结构蛋白发生反应,但反应发生的结构蛋白大小不同,43B6-H2和75E2-F3识别相同分子大小的蛋白,在25-35KD之间。27C9-C5-D8识别约55KD蛋白,分别应对应于PEDV M蛋白和N蛋白,对三株单克隆抗体进行的叠加ELISA结果也表明,43B6-H2和75E2-F3识别同一个抗原表位,而27C9-C5-D8识别不同的抗原位点;间接免疫荧光结果表明,三株单克隆抗体与感染PEDV的Vero细胞反应,均能产生特异性荧光信号,而与感染猪传染性胃肠炎病毒的细胞不发生反应;综上所述,所制备的三株单克隆抗体对PEDV具有良好的特异性,为PED病原的诊断提供了重要的物质基础。在PEDV单克隆抗体制备的基础上,利用纯化的兔抗PEDV血清作为捕获抗体,过氧化物酶标记的单克隆抗体为检测试剂,通过各项条件的优化,建立了双抗体夹心ELISA检测PEDV主要反应条件:即将兔抗PEDV多抗稀释为浓度为2.8μg/m L,每孔加入100μL,37℃包被1 h之后包被过夜,取出后,用洗板机洗板3次,每次每孔加入200μL的1×磷酸盐吐温缓冲液洗涤5 min;然后加入5%脱脂乳200μL/孔封闭过夜,取出后,用洗板机洗板3次,每次每孔加入200μL的1×磷酸盐吐温缓冲液洗涤5 min,之后加入病毒培养物200μL,或者用磷酸盐缓冲液等比稀释的粪便样品200μL,37℃作用90min,甩去样品液,用洗板机洗板3次,每次每孔加入200μL的1×磷酸盐吐温缓冲液洗涤,每次5 min,加入浓度为7.5μg/m L的酶标记单抗,每孔加入100μL,37℃条件作用90 min,用洗板机洗板3次,每次每孔加入200μL的1×磷酸盐吐温缓冲液洗涤,每次5 min,每孔加入100μL的TMB显色液工作液,37℃避光显色10 min后,每孔加入50μL终止液,终止显色,OD450nm测定。本检测方法不与猪传染性胃肠炎（TGE）,猪轮状病毒（Po RV）,发生交叉反应;其病毒最低检测限度为3.125×103TCID50/m L;板内阳性样品变异系数为1.22%-3.66%,板内阴性样品变异系数为2.90%-8.72%;板间阳性变异系数为3.76%-7.03%,板间阴性样品变异系数为3.62%-9.32%,所有变异系数均小于10%。通过对47份病料的初步检测并与RT-PCR方法和金标免疫层析试纸条检测结果进行对比,检测结果显示,RT-PCR检测为阴性的样品,双抗体夹心ELISA和金标免疫层析试纸条检测也均为阴性;RT-PCR方法检测出的21份阳性样品,双抗体夹心ELISA共检测出19份阳性样品,金标免疫层析试纸条共检测只有14份阳性样品。从结果看,本方法的阳性检出率是介于RT-PCR和金标免疫层析试纸条之间。

论文目录

  • 摘要
  • 英文摘要
  • 1 前言
  •   1.1 PED流行特征及其危害
  •   1.2 PEDV病原学特征
  •     1.2.1 PEDV的形态特征和主要理化特性
  •     1.2.2 PEDV核酸结构
  •     1.2.3 PEDV的结构蛋白
  •     1.2.4 PEDV的培养特性
  •   1.3 PED的诊断
  •     1.3.1 PED的临床诊断
  •     1.3.2 PED特异性诊断
  •   1.4 单克隆抗体在疾病诊断方面的应用
  •   1.5 研究目的和意义
  • 2 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 细胞与病毒
  •     2.1.2 实验动物
  •     2.1.3 临床粪便样品
  •     2.1.4 抗体制剂
  •     2.1.5 主要试剂
  •     2.1.6 主要试剂配制
  •     2.1.7 主要仪器设备
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 免疫原的制备
  •     2.2.2 实验动物免疫
  •     2.2.3 杂交瘤筛选方法的建立
  •     2.2.4 分泌PEDV抗体阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆
  •     2.2.5 单克隆抗体效价的测定
  •     2.2.6 单克隆抗体的特征性鉴定
  •     2.2.7 双抗体夹心ELISA方法的建立
  •     2.2.8 双抗体夹心ELISA方法的优化
  •     2.2.9 双抗体夹心ELISA方法的灵敏性试验
  •     2.2.10 双抗体夹心ELISA方法的特异性试验
  •     2.2.11 双抗体夹心ELISA方法的重复性试验
  •     2.2.12 双抗体夹心ELISA方法检测临床样品
  • 3 结果
  •   3.1 PEDV的增殖及鉴定
  •     3.1.1 PEDV的增殖
  •     3.1.2 PEDV-Px株 TCID50 的测定
  •     3.1.3 PEDV的纯化
  •   3.2 杂交瘤细胞株筛选ELISA的建立
  •   3.3 分泌抗PEDV抗体的杂交瘤细胞株筛选结果
  •   3.4 单克隆抗体效价的测定
  •   3.5 单克隆抗体特性鉴定
  •     3.5.1 单克隆抗体亚型的鉴定
  •     3.5.2 杂交瘤细胞分泌单克隆抗体稳定性的鉴定结果
  •     3.5.3 Western blot鉴定及结合表位分析
  •     3.5.4 IFA鉴定
  •     3.5.5 单克隆抗体特异性的鉴定
  •   3.6 双抗体夹心ELISA方法的建立
  •     3.6.1 抗体的纯化鉴定及HRP标记浓度的确定
  •     3.6.2 兔抗PEDV多抗与单克隆抗体适宜工作浓度的确定
  •     3.6.3 双抗体夹心ELISA各条件测定
  •     3.6.4 双抗体夹心ELISA方法灵敏性测定
  •     3.6.5 双抗体夹心ELISA检测PEDV的特异性
  •     3.6.6 双抗体夹心ELISA检测PEDV重复性结果
  •     3.6.7 临床样品的检测
  • 4 讨论
  •   4.1 制备的单克隆抗体主要特性
  •   4.2 PEDV抗原检测双抗体夹心ELISA的建立和优化
  •   4.3 双抗体夹心ELISA对临床样本的检测
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 马宇聪

    导师: 李一经

    关键词: 猪流行性腹泻病毒,单克隆抗体,双抗体夹心

    来源: 东北农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 东北农业大学

    分类号: S852.4

    总页数: 58

    文件大小: 2132K

    下载量: 287

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