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HeLa细胞核抽出物中一种新的具有H2A.Z置换活性组分的纯化和鉴定

2020-12-02阅读(340)

HeLa细胞核抽出物中一种新的具有H2A.Z置换活性组分的纯化和鉴定

论文摘要

在真核细胞中,遗传信息储存在DNA中并且以核小体为基本单位装载在染色质中。H2A.Z是存在于酵母和人细胞中的H2A一个高度保守的变体,它在染色质中的存在被认为与基因转录调控、DNA损伤修复、基因组稳定性相关。将组蛋白变体置换进、出染色质是染色质重塑中非常重要的组成部分。已经有很多发表的论文中报导了一些具有H2A.Z置换功能的酶。酵母中Swr1和它在人细胞中的两个同源物SRCAP和P400/TIP60是已经比较清楚的被证实的具有活性的染色质重塑酶。最近的研究表明,H2A..Z可以被TIP60置换进DSB（DNA双链断裂）位点,而不依赖于TIP60的乙酰基转移酶活性。H2A.Z缺失会导致非同源末端连接（NHEJ）复合物KU70/KU80无法募集到DSB部位,使DSB的修复过程无法继续。H2A.Z被置换进核小体是发挥了基因转录激活亦或抑制作用还不十分清楚,但是H2A.Z在promoter区临近核小体的存在会导致DNA对于RNA聚合酶可接近性的改变,从而能影响基因转录。另外,H2A.Z在DSB损伤修复中也起着非常重要的作用。为了筛选其它并没有被发现可能具有H2A.Z置换功能的蛋白组分,我们将100LHeLa细胞核抽出物蛋白进过多次柱层析分离,并应用体外组蛋白变体置换实验跟踪置换活性。我们发现了能够将H2A.Z置换进核小体的蛋白活性组分,之后我们进一步在体内、体外实验中证实该蛋白组分的H2A.Z置换活性及其相关特性。蛋白质谱结果显示活性组分中富含DNA-PKcs和condensin complexⅡ的所有亚基的肽段。在之后进行的亲水一疏水层析中,这两个蛋白组分的募集峰分开了,并且蛋白峰的体外H2A.Z置换活性主要存在于DNA-PKcs的组分中。进一步的实验发现,体外纯化的condensin复合物没有H2A.Z的置换活性,说明具有H2A.Z置换活性的蛋白是DNA-PKcs。另外,利用从细胞中纯化的DNA-PKcs蛋白也证实其具有体外H2A.Z置换活性,并且随着DNA-PKcs的添加量的增加,置换活性也逐渐增加。由于H2A.Z在DNA双链断裂之后在损伤位点附近有募集,我们在两种损伤细胞模型中敲低DNA-PKcs观察其对H2A.Z募集的影响。在X射线辐射模型中,H2A.Z在1h左右有募集,敲低DNA-PKcs能够导致H2A.Z募集峰丰度降低和滞后。在40HT诱导的DNA双链断裂模型中,敲低DNA-PKcs可以导致H2A.Z在DSB部位的募集明显滞后（滞后了 2h）。接下来我们对DNA-PKcs调控H2A.Z置换的分子机制进行了研究,发现DNA-PKcs可能是通过磷酸化H2A,改变染色质结构,进而将H2A.Z置换入染色质中,并且这种活性能被DNA-PKcs的激酶抑制剂NU7026所抑制。但是DNA-PKcs在此过程中有没有磷酸化其它蛋白,以及H2A被DNA-PKcs磷酸化的位点等,还有待进一步验证。综上所述,我们认为DNA-PKcs是一种新的具有将H2A.Z置换入核小体功能的蛋白,这种置换活性与其对H2A的磷酸化相关,但它具体的作用机制仍有待进一步的研究。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第1章 绪论
  •   1.1 表观遗传学的概念
  •   1.2 表观遗传学的分子机制
  •     1.2.1 DNA甲基化
  •     1.2.2 组蛋白修饰
  •     1.2.3 染色质重塑
  •     1.2.4 RNA干扰
  •   1.3 染色质重塑复合物
  •     1.3.1 染色质重塑的概念
  •     1.3.2 重塑复合物的分类和作用机制
  •     1.3.3 组蛋白变体的置换
  •   1.4 DNA-PKcs蛋白的结构和功能
  •     1.4.1 DNA-PKcs的结构
  •     1.4.2 DNAPK complex在DNA修复中的作用
  •     1.4.3 DNA-PKcs在癌症发生发展中的作用
  •     1.4.4 DNA-PKcs在P53介导的细胞凋亡中的作用
  • 第2章 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 实验仪器
  •     2.1.2 实验试剂
  •     2.1.3 实验抗体
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 细胞培养及处理
  •     2.2.2 质粒瞬时转染
  •     2.2.4 免疫荧光染色实验
  •     2.2.5 体外重组核小体
  •     2.2.6 体外核小体置换实验
  •     2.2.7 染色质抽提实验
  •     2.2.9 慢病毒包装与感染
  • 第3章 实验过程与结果讨论
  •   3.1 体外核小体置换实验模型的建立与验证
  •     3.1.1 引言
  •     3.1.2 体外重组核小体
  •     3.1.3 体外组蛋白置换模型的有效性验证
  •     3.1.4 小结
  •   3.2 HeLa细胞核抽出物中含有DNA-PK-cs和 condensin complexII的蛋白组分具有体外置换组蛋白的能力
  •     3.2.1 引言
  •     3.2.2 HeLa细胞中蛋白组分的分离及H2A.Z置换功能鉴定
  •     3.2.3 对活性组分H2A.Z置换活性的进一步验证
  •     3.2.4 活性组分中蛋白成分的鉴定
  •     3.2.5 不同步骤的纯化方法锁定具有活性的蛋白
  •     3.2.6 小结
  •   3.3 DNA-PKcs和Condensin complexII在细胞内的相互作用
  •     3.3.1 引言
  •     3.3.2 对活性组分进一步的分离
  •     3.3.3 内源蛋白的免疫共沉淀实验
  •     3.3.4 稳转细胞系中二者的免疫共沉淀实验
  •     3.3.5 损伤模型中DNA-PKcs和 condensin complexII的定位
  •     3.3.6 小结
  •   3.4 纯化的DNA-PKcs和 condensin complexII是否具有体外置换组蛋白的能力
  •     3.4.1 引言
  •     3.4.2 nCAPH2蛋白对H2A.Z的置换活性很弱。
  •     3.4.3 DNA-PKcs蛋白在体外具有H2A.Z置换活性
  •     3.4.4 DNA-PKcs通过激酶活性发挥H2A.Z置换功能
  •     3.4.5 DNA-PKcs对 H2A.Z的置换是否具有特异性
  •     3.4.6 小结
  •   3.5 DNA损伤模型中DNA-PKc对 H2A.Z募集情况的影响
  •     3.5.1 引言
  •     3.5.2 在X射线损伤模型中敲低DNA-PKcs对 H2A.Z募集的影响。
  •     3.5.3 在ASI-U2OS细胞系中敲低DNA-PKcs对 H2A.Z募集的影响
  •     3.5.4 小结
  • 第4章 讨论
  • 参考文献
  • 作者简介及攻读博士学位期间发表的学术成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 王羚瑶

    导师: 蔡勇

    关键词: 染色质重塑,组蛋白变体,双链损伤

    来源: 吉林大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 吉林大学

    分类号: Q75

    总页数: 93

    文件大小: 7584K

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