J亚群禽白血病病毒的分离及p27嵌合蛋白的构建及表达

论文摘要

J亚群禽白血病病毒（Subgroup J Avian Leukosis Virus,ALV-J）在世界各地广泛流行,能引起禽类多种具有传染性的良性和恶性肿瘤疾病,造成巨大的经济损失。ALV-J在我国宿主范围已由商品种鸡扩大至本地品种鸡,且没有有效防治的疫苗或药物,净化种鸡场是唯一的防控方式。因此对祖代种鸡场进行禽白血病病毒的检测监控以及禽白血病病毒快速、准确、有效的检测方法的建立具有重要的意义。本研究从华东某地方品种祖代种鸡场采集998份公鸡精液样品,经ALV ELISA抗原检测试剂盒检测,DF-1细胞分离,最终分离出一株ALV命名为G4-4。检出率为5.51%（55/998）,分离率为1.82%（1/55）。经ALV亚群特异性引物鉴定,分离株G4-4为ALV-J。G4-4的p27基因序列与A、B、C、D、E、J、K亚群毒株的p27基因相似在91.8%98.4%,其中,G4-4与J亚群的JS09GY3相似性高达98.4%。遗传进化分析发现G4-4与JS09GY3划分为同一分支,说明两者亲缘性较近。G4-4的gp85基因序列与A、B、C、D、K、E亚群毒株的gp85基因相似在46.7%85.6%,与J亚群的毒株JS09GY3的gp85基因相似性高达99.4%。遗传进化分析发现,分离株G4-4与J亚群和E亚群禽白血病病毒处于同一大分支,而A、B、C、D、K亚群的毒株处于另一大分支。此外,分离株与JS09GY3和JS09GY6毒株处于同一小分支,说明亲缘关系较近。为了制备抗禽白血病病毒p27蛋白高免血清,本研究利用生物学软件筛选出多个ALV-J的p27抗原表位,并用丝氨酸与甘氨酸串联,克隆至P-particle表达载体,命名为pp354。经过蛋白表达验证,重组蛋白pp354大小约为73 kD。重组蛋白pp354在温度为25℃、IPTG浓度为0.4 mM、恒温振荡培养8 h时表达量最高,此表达条件下重组蛋白可溶性约为50%。ELISAALV抗原检测试剂盒结果表明重组蛋白可有效与p27抗体结合,具有p27蛋白抗原性,且用ALV-J阳性血清进行Western blot鉴定,在73 kD处有明显条带。ALV-J的不断流行和扩散要求我们要建立ALV-J阴性祖代种鸡群,而ALV-J抗原检测试剂盒的开发是实现这一目标的基础。针对目前商品化ALV-J检测试剂盒和检测方法存在的诸如昂贵、假阳性率高等缺陷和不足,建立一种能表达出识别ALV-J特异抗原片段的蛋白表达平台对于ALV-J商品化检测方法的建立以及ALV-J的净化有着很大的帮助。本研究对华东某地方品种祖代种鸡场采集的样品进行ALV-J分离分析,并利用P-particle表达载体构建具有p27抗原性的重组蛋白pp354,为ALV-J p27特异性抗体的产生以及国产商品化ALV p27抗原ELISA检测试剂盒的研发奠定基础。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 曾依翎

导师: 许丹宁,孙铭飞

关键词: 亚群禽白血病病毒,病毒分离与分析,嵌合蛋白,表达载体,蛋白表达与分析

来源: 仲恺农业工程学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 仲恺农业工程学院

基金: 十三五国家重点研发计划项目(2016YFD0501605),广东省科技计划重点项目(2017B020202010),广东省水禽健康养殖重点实验室(2017-2019)

分类号: S852.65

总页数: 57

文件大小: 15621K

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