仔猪先天性震颤瘟病毒基因组序列及主要免疫原基因的原核表达分析

论文摘要

仔猪先天性震颤（Congenital Tremors,CT）,又称为传染性先天性震颤、“仔猪抖抖病”,是新生仔猪出现全身或局部肌肉阵发性挛缩为特征的一种传染性疾病。临床上有的整窝发病,有的部分发病,甚至症状可延续到保育猪和育肥前期猪,严重影响猪的生长和成活率,给养猪业造成较大的经济损失。仔猪先天性震颤瘟病毒（Atypical Porcine Pestivirus,APPV）,是一种新发现的,可引起CT的瘟病毒属成员。但到目前为止,未见APPV分离成功的报道,其生物学特性,快速检测和防控等仍是研究的重点。本试验对APPV快速检测方法,基因组序列,分离和主要免疫原基因的蛋白表达等进行研究,以期为APPV及CT进一步研究和防控奠定基础。1、APPV RT-PCR检测方法的建立及应用以GenBank中APPV全基因组序列作为参考序列,设计一对引物;以临床疑似CT的病死猪病料为样本,提取RNA作模板,通过优化条件和序列测定,建立检测APPV的RT-PCR方法。结果表明,从CT病死猪的淋巴结中扩增到与预期片段大小一致的片段,经序列测定和比对分析,扩增片段核苷酸序列与GenBank中的APPV相应片段的核苷酸序列相似性在89%以上;建立的RT-PCR方法只能扩增出APPV片段,而其它几种猪常见病毒均为阴性,3次重复检测结果基本一致,且可检测的最低cDNA浓度为184.11 ng/μL;对临床送检的病料进行检测,疑似CT病例的检出率达100%。结果表明,建立的RT-PCR方法具有良好的特异性、重复性、敏感性等优点,可用于临床疑似APPV引起CT的快速检测,以及病毒鉴定和分子流行病学调查。2、1株APPV全基因组的序列测定、分析与第2株部分APPV序列分析以APPV阳性病料为待检样品,根据GenBank中的APPV全基因组序列,设计7对引物,进行RT-PCR,序列测定和拼接,并利用MEGA7.0软件和DNAStar软件绘制进化树并进行相似性分析。结果显示,其中1份病料扩增到7个基因片段,经拼接,获得1株APPV全基因组序列,命名为JX-JM01-2018A01（GenBank登录号:MG792803.1）,另1份病料仅扩增拼接出约8000 nt的片段,命名为JX-02,包含完整的主要免疫原E0和E2的基因、瘟病毒属病毒非保守的NS2-3基因序列。JX-JM01-2018A01全基因组长11.5 kb,与GenBank中的APPV位于同一进化分支,而BVDV及BDV等其它动物瘟病毒在另一进化分支;与GenBank中的APPV参考全基因组序列似性在82.5%93.2%之间;JX-JM01-2018A01和JX-02的E0、E2和NS2-3的核苷酸序列与GenBank收录的APPV相应序列相似性分别为:82.5%93.2%,82.3%93.1%,80.3%92.9%;推测氨基酸序列同源性分别为:38.4%51.6%,33.0%37.2%,36.0%39.0%。E0、E2、NS2-3的进化树分析表明,JX-JM01-2018A01和JX-02位于同一进化分支,进化距离近,与BVDV、BDV等其它动物瘟病毒位于不同的进化分支。3、APPV的初步分离和鉴定取检测为强阳性的病料,经处理后分别接种于PK-15细胞、IBRS-2细胞,制备APPV阳性新生仔猪脑原代细胞、接种处理的病料悬液。结果,接毒的PK-15细胞盲传20代,仅F1和F6细胞液可检测到与目的片段大小一致的核苷酸片段,序列测序结果也表明片段是APPV,其它代次均为阴性;IBRS-2细胞接毒后盲传10代,经检测均为阴性;APPV阳性新生仔猪的脑原代细胞体外培养7天,检测APPV为阴性,接毒后培养、传代3次,经检测APPV均为阴性。4、APPV免疫保护原基因E0、E2蛋白的原核表达根据JX-JM01-2018A01全基因组序列,设计引物,扩增完整的主要保护性抗原基因E0、E2,构建重组原核表达载体pET-E0、pET-E2、pGEX-E0、pGEX-E2,经优化诱导表达条件,结果均不能表达出目的蛋白产物。将E0、E2基因序列进行密码子优化,再构建重组表达载体pET-E0y、pET-E2y、pGEX-E0y,经优化诱导条件,SDS-PAGE检测,均可表达出目的大小一致的蛋白;以重组蛋白GST-E0y进行小白鼠免疫,以重组蛋白HIS-E0y为检测抗原,经检测,免疫小白鼠均能产生高水平的抗体。

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摘要

Abstract

第一章文献综述

1 病原

2 流行病学

3 临床症状

4 病理变化

5 诊断

6 防治

第二章 APPV RT-PCR检测方法的建立及应用

1 实验材料

1.1 病料

1.2 设备

1.3 试剂

1.4 液体试剂的配置

2 实验方法

2.1 引物设计

2.2 组织RNA的提取

2.3 反转录

2.4 PCR

2.5 特异性试验

2.6 重复性试验

2.7 敏感性试验

2.8 临床样品的检测

3 结果

3.1 RT-PCR

3.2 特异性试验

3.3 重复性试验

3.4 敏感性试验

3.5 样品的检测

3.6 序列分析

5 讨论

第三章 APPV基因组序列测定及进化分析

1 实验材料

1.1 病料

1.2 实验器材

1.3 实验的试剂

1.4 实验液体试剂的配置

2 实验方法

2.1 引物设计

2.2 病料处理

2.3 RNA提取与反转录

2.4 PCR产物的序列测定、分析及演化分析

3 结果

3.1 RT-PCR

3.2 序列测定与拼接

3.3 APPV基因序列分析

3.3.1 APPV全基因组序列分析

3.3.2 分子进化分析与相似性分析

3.3.3 E0的分子进化及相似性分析

3.3.4 E2的分子进化及相似性分析

3.3.5 NS2-3的分子进化及相似性分析

3.3.6 NS5B的分子进化及相似性分析

4 讨论

第四章 APPV的初步分离与鉴定

1 实验材料

1.1 样品

1.2 实验器材

1.3 实验的试剂

1.4 实验液体试剂的配置

2 实验方法

2.1 引物设计

2.2 猪肾传代细胞系的培养及接种

2.3 CT仔猪脑原代细胞的培养和接毒

3 实验结果

3.1 PK-15细胞分离病毒鉴定结果

3.2 IBRS-2细胞分离病毒结果

3.3 CT仔猪脑原代细胞的分离和培养

4 讨论

第五章 APPV E0和E2基因的原核表达

1 材料

1.1 实验小鼠

1.2 仪器

1.3 菌种、质粒

1.4 试剂、培养基的配置

1.5 SDS-PAGE试剂的配置

2 方法

2.1 引物设计

2.2 病毒RNA的提取

2.3 RT-PCR

2.3.1 反转录

2.3.2 PCR

2.4 pET-32a、pGEX-4T-1 质粒提取

2.5 PCR产物和质粒的双酶切

2.5.1 双酶切体系

2.5.2 双酶切产物胶回收

2.6 连接

2.6.1 连接

2.6.2 转化

2.7 菌液PCR

2.8 重组质粒双酶切鉴定

2.9 序列测序

2.10 重组质粒转化BL21及鉴定

2.11 重组菌的诱导表达

2.11.1 诱导表达

2.11.2 SDS-PAGE

2.12 条件优化

2.12.1 诱导时间的选择

2.12.2 IPTG终浓度的选择

2.13 E0、E2 序列优化与质粒的构建

2.13.1 E0/E2 序列优化

2.13.2 E0y和 E2y原核表达质粒的构建

2.13.3 诱导表达

2.13.4 SDS-PAGE

2.14 表达蛋白的纯化

2.14.1 样品制备

2.14.2 超声波裂解

2.14.3 SDS-PAGE

2.14.4 重组蛋白的纯化

2.15 包涵体复性

2.15.1 样品的准备

2.15.2 超声波裂解

2.15.3 包涵体洗涤

2.15.4 包涵体的透析复性

2.15.5 重组蛋白的浓度测定

2.16 小鼠免疫

3 结果

3.1 APPV E0、E2序列扩增结果

3.2 E0、E2基因密码子优化

3.2.1 E0基因密码子优化

3.2.2 E2基因密码子优化

3.3 重组质粒的双酶切鉴定结果

3.3.1 重组质粒pET-E2和pET-E2y的双酶切

3.3.2 E0、E0y基因重组质粒的双酶切鉴定

3.4 重组表达菌的菌液PCR鉴定

3.4.1 E0 重组质粒表达菌的鉴定结果

3.4.2 E2 基因重组质粒表达菌的菌液PCR鉴定

3.5 SDS-PAGE结果

3.6 重组pET-E0y诱导条件优化

3.6.1 诱导时间

3.6.2 IPTG 浓度

3.7 pGEX-E0y诱导条件优化

3.7.1 诱导时间

3.7.2 IPTG浓度

3.8 重组蛋白包涵体的纯化与复性

3.8.1 重组蛋白His-E0y的可溶性分析与包涵体的纯化

3.8.2 重组蛋白GST-E0y的可溶性分析与包涵体的复性

3.9 重组蛋白His-E0y、GST-E0y的浓度测定

3.10 免疫小鼠抗体效价的测定

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

论文发表情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吴松松

导师: 邓舜洲,张文波

关键词: 仔猪先天性震颤,仔猪先天性震颤瘟病毒,进化树,病毒分离,原核表达

来源: 江西农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 江西农业大学

分类号: S852.651

DOI: 10.27177/d.cnki.gjxnu.2019.000357

总页数: 70

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仔猪先天性震颤瘟病毒基因组序列及主要免疫原基因的原核表达分析

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