首页> 正文

PRV变异株GZDZ2016的分离鉴定与TK基因缺失转移载体的构建

2020-12-08阅读(620)

PRV变异株GZDZ2016的分离鉴定与TK基因缺失转移载体的构建

论文摘要

伪狂犬病病毒为双股DNA病毒,隶属于疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科,全长约150 kb,GC含量高达73%。猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒引起的以神经症状、繁殖障碍为主要特征的严重危害我国养猪业的持续健康发展的疾病,在我国各省规模化猪场普遍存在。据童武2013年报道,自2011年以来中国各省先后发生PR疫病,且免疫PRV疫苗的猪场仍发生,发病率和死亡率明显上升,毒株分离鉴定结果显示,引起该病大规模爆发的病原为变异的猪伪狂犬病毒。贵州省部分已免疫PRV Bartha-K61疫苗株的猪场,也发生类似的PR疫病。2016年贵州省丹寨县某规模化种猪场,在已免疫PRV Bartha-K61疫苗的情况下,部分种猪先后发生流产、产死胎和木乃伊胎,后经实验室诊断确诊为感染PRV野毒所致。为了解该病例中PRV毒株的情况,本研究应用Vero细胞对其进行了分离和鉴定,证实该分离毒株系一株PRV变异毒株（GZDZ2016）,并基于该毒株基因序列构建了TK基因缺失转移载体,为PRV变异株TK基因缺失疫苗的研究奠定了基础。1.PRV变异株GZDZ2016的分离鉴定本研究取2016年丹寨县某猪场送检的经实验室确诊为PRV阳性的流产胎儿组织样品,经系列处理后接种于Vero细胞进行传代分离,并应用电镜技术对分离的PRV进行形态学观察,对病毒效价、一步生长曲线及部分基因序列等进行了测定。分离鉴定结果显示,当盲传至第5代时开始产生CPE,至第7代时呈现稳定的CPE,表现为细胞变圆、脱落、呈拉网状等典型CPE;透射电镜下可见位于囊泡中呈近似圆形的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体以及空心、实心2种无囊膜的病毒粒子;分离的病毒在Vero细胞上的生长滴度为10-8.12/0.1mL,一步生长曲线显示该病毒滴度在12 h内处于潜伏期,从12 h以后到56 h之间呈增长趋势,至60 h滴度达最大;将分离毒株接种家兔,2天后出现奇痒、亢奋的症状,3天后死亡;后取保存备用的第11代细胞培养液进行gD部分基因的扩增,并对测序结果进行分析,PCR扩增产物经测序证明系PRV gD基因的部分序列。结果表明,成功分离获得了1株猪伪狂犬病病毒贵州株,命名为PRV GZDZ2016株。本试验通过设计合成特异性引物,通过PCR方法扩增了分离株的gB、gC、gD、gE和TK基因,预期大小分别为:2784bp、1651 bp、1273 bp、、1752 bp、1535 bp,并对gC、gD、gE和TK基因进行克隆测序,将测序结果与国内外毒株基因序列进行比对和序列相似性分析,用推导的氨基酸序列绘制系统发育进化树。序列相似性分析结果表明:该分离株主要基因与变异株相似性较高,而与国外毒株相似性较低。序列比对结果显示,该分离株gB、gC、gE和TK蛋白分别有不同数量的氨基酸的变异,gE蛋白第48位和496位均有天冬氨酸（D）的插入,第236位由亮氨酸（L）变为脯氨酸（P）;TK蛋白第6位由异亮氨酸（I）变为丙氨酸（A）,第157位由天冬氨酸（D）变为甘氨酸（G）;gC蛋白第81位由组氨酸（V）变为丙氨酸（A）;gB蛋白与国外毒株在第55、70、7273等位存在明显的氨基酸差异;gD蛋白与2012年后分离的HeN1、TJ、JS2012株等变异毒株未存在氨基酸差异。遗传进化分析结果显示,该分离株与国内近年来分离的变异毒株亲缘关系较近,而与国内外分离的经典毒株亲缘关系较远。以上结果均表明,该分离株属于国内近几年流行的变异毒株,命名为PRV变异株GZDZ2016。2.PRV变异株GZDZ2016 TK基因缺失转移载体的构建设计特异性引物分别扩增PRV变异株GZDZ2016 TK基因上下游同源臂TKL、TKR,大小分别为1066 bp、906 bp。设计特异性引物从pCMV-beta质粒中扩增出报告基因LacZ,大小为4062 bp。将pMD19T-TKR质粒经HindⅢ、EcoRⅠ双酶切后,亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体,构建pcDNA3.1-TKR质粒,其大小为6334 bp。之后,再将pMD19T-TKL质粒经NheⅠ-HindⅢ双酶切后,亚克隆至pcDNA3.1-TKR质粒载体中,构建pcDNA3.1-TKL-TKR质粒,其大小为7400 bp。最后,将报告基因LacZ的扩增产物,通过HindⅢ酶切后,克隆至pcDNA3.1-TKL-TKR质粒载体中,构建pcDNA3.1-TKL-LacZ-TKR质粒,该质粒测序鉴定结果表明大小为11462 bp,与预期结果相符。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 病原学
  •     1.1.1 分类
  •     1.1.2 病毒的形态特征
  •     1.1.3 PRV基因组结构
  •     1.1.4 病毒的理化特性和培养特性
  •   1.2 分子生物学特性
  •   1.3 伪狂犬病病毒的致病机理
  •   1.4 伪狂犬病的流行病学
  •   1.5 伪狂犬病的临床特征
  •   1.6 伪狂犬病变异株研究概况
  •     1.6.1 PR新疫病
  •     1.6.2 PRV变异株基因特征的差异
  •   1.7 伪狂犬病疫苗研究进展
  •   1.8 研究目的和意义
  • 第二章 PRV变异株GZDZ2016的分离鉴定
  •   1 材料
  •     1.1 病料来源
  •     1.2 实验动物
  •     1.3 传代细胞
  •     1.4 主要试剂
  •     1.5 主要实验仪器
  •   2 方法
  •     2.1 病毒分离
  •       2.1.1 病料处理
  •       2.1.2 细胞培养
  •       2.1.3 病毒的分离
  •     2.2 病毒鉴定
  •       2.2.1 核酸鉴定
  •       2.2.2 形态学观察
  •       2.2.3 病毒效价的测定及生长曲线绘制
  •       2.2.4 动物接种试验
  •       2.2.5 PRV分离毒株主要基因的T克隆
  •   3 结果
  •     3.1 细胞病变观察
  •     3.2 病毒核酸鉴定
  •     3.3 病毒形态结构
  •     3.4 病毒效价及一步生长曲线
  •     3.5 动物接种试验
  •     3.6 PRV GZDZ2016株主要基因的克隆测序
  •       3.6.1 PRV GZDZ2016株gB基因的PCR扩增结果
  •       3.6.2 PRV GZDZ2016株gC基因的PCR扩增结果
  •       3.6.3 PRV GZDZ2016株gD基因的PCR扩增结果
  •       3.6.4 PRV GZDZ2016株gE基因的PCR扩增结果
  •       3.6.5 PRV GZDZ2016株TK基因的PCR扩增结果
  •     3.7 PRV GZDZ2016株主要基因阳性质粒的鉴定
  •       3.7.1 PRV GZDZ2016株gC基因阳性质粒的鉴定
  •       3.7.2 PRV GZDZ2016株gD基因阳性质粒的鉴定
  •       3.7.3 PRV GZDZ2016株gE基因阳性质粒的鉴定
  •       3.7.4 PRV GZDZ2016株TK基因阳性质粒的鉴定
  •     3.8 PRV GZDZ2016株序列比对结果
  •       3.8.1 PRV GZDZ2016株测序结果
  •       3.8.2 PRV GZDZ2016株gE基因序列比对
  •       3.8.3 PRV GZDZ2016株TK基因序列比对
  •       3.8.4 PRV GZDZ2016株gD基因序列比对
  •       3.8.5 PRV GZDZ2016株gC基因序列比对
  •       3.8.6 PRV GZDZ2016株gB基因序列比对
  •   4 讨论
  •   5 结论
  • 第三章 PRV变异株GZDZ2016 TK基因缺失转移载体的构建
  •   1 材料
  •     1.1 主要试剂
  •     1.2 菌种与质粒载体
  •     1.3 主要实验仪器
  •   2 方法
  •     2.1 引物设计与合成
  •     2.2 PRV变异株GZDZ2016基因组的提取
  •     2.3 同源重组臂（TKL、TKR）的PCR扩增
  •     2.4 报告基因（Lac Z）的PCR扩增
  •     2.5 同源重组臂（TKL、TKR）的克隆与鉴定
  •       2.5.1 同源重组臂PCR扩增产物的回收与纯化
  •       2.5.2 连接
  •       2.5.3 转化
  •       2.5.4 重组质粒的小量提取
  •       2.5.5 质粒PCR鉴定和双酶切鉴定
  •     2.6 TK转移载体的构建策略
  •       2.6.1 pc DNA3.1-TKR载体的构建
  •       2.6.2 pc DNA3.1-TKL-TKR载体的构建
  •       2.6.3 pc DNA3.1-TKL-Lac Z-TKR载体的构建
  •   3 结果
  •     3.1 PRV变异株GZDZ2016株左右臂（TKL、TKR）的PCR扩增结果
  •     3.2 Lac Z报告基因的PCR扩增结果
  •     3.3 重组质粒p MD19T-TKR的酶切鉴定
  •     3.4 重组质粒p MD19T-TKL的酶切鉴定
  •     3.5 重组质粒pc DNA3.1-TKR的鉴定
  •       3.5.1 重组质粒pc DNA3.1-TKR的双酶切鉴定
  •       3.5.2 重组质粒pc DNA3.1-TKR的质粒PCR鉴定
  •     3.6 重组质粒pc DNA3.1-TKL-TKR的鉴定
  •       3.6.1 重组质粒pc DNA3.1-TKL-TKR的双酶切鉴定
  •       3.6.2 重组质粒pc DNA3.1-TKL-TKR的质粒PCR鉴定
  •     3.7 重组质粒pc DNA3.1-TKL-Lac Z-TKR的鉴定
  •       3.7.1 重组质粒pc DNA3.1-TKL-Lac Z-TKR的鉴定
  •       3.7.2 重组质粒pc DNA3.1-TKL-Lac Z-TKR的质粒PCR鉴定
  •       3.7.3 p CDNA3.1-TKL-Lac Z-TKR序列比对
  •   4 讨论
  •   5 结论
  • 参考文献
  • 附录一 攻读硕士学位期间所取得得成果
  • 附录二 pcDNA3.1-TKL-LacZ-TKR序列
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 何小莉

    导师: 曾智勇,马萍

    关键词: 猪伪狂犬病病毒,变异株,分离鉴定,遗传变异分析,缺失转移载体的构建

    来源: 贵州大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 贵州大学

    基金: 贵州大学引进人才科研项目,规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究,合同编号:贵大人基合字(2016)73号

    分类号: S852.65

    总页数: 86

    文件大小: 2370K

    下载量: 66

    相关论文文献

    • [1].我国传染性法氏囊病病毒新型变异株分析研究[J]. 中国预防兽医学报 2019(11)
    • [2].布氏菌104M变异株毒力及保护力研究[J]. 微生物学免疫学进展 2017(04)
    • [3].蛋鸡感染传染性法氏囊病病毒新型变异株的鉴定[J]. 中国家禽 2020(05)
    • [4].诺如病毒GⅡ.4亚型新变异株全基因组序列的研究[J]. 国际检验医学杂志 2017(02)
    • [5].PRRSV经典株与变异株RT-PCR鉴别方法的建立及应用[J]. 福建畜牧兽医 2013(06)
    • [6].多重RT-PCR区分PRRSV变异株和经典株方法的建立[J]. 金陵科技学院学报 2010(02)
    • [7].我国猪伪狂犬病变异株研究概况[J]. 中国猪业 2016(08)
    • [8].猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与变异株RT-PCR鉴别诊断方法的建立及应用[J]. 中国畜牧兽医 2012(08)
    • [9].离子束辐射致番茄变异株花粉活力的研究[J]. 中国果菜 2010(02)
    • [10].鸡腺病毒血清4型变异株荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 中国兽医科学 2019(08)
    • [11].PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法的建立与应用[J]. 河南农业科学 2009(09)
    • [12].南宁市婴幼儿散发性腹泻中诺如病毒基因Ⅱ组4型变异株的流行特征[J]. 中国疫苗和免疫 2015(02)
    • [13].高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒四川变异株致病性分析[J]. 中国预防兽医学报 2017(11)
    • [14].‘异株’荨麻组织培养技术体系的建立[J]. 分子植物育种 2020(07)
    • [15].鸡传染性法氏囊病毒新型变异株的分离鉴定[J]. 家禽科学 2020(07)
    • [16].长圆形纽荷尔脐橙变异株植物学特性描述及RAPD分析鉴定[J]. 山西农业科学 2012(05)
    • [17].湖南首届规模猪场变异株腹泻成果研讨会在长沙举行[J]. 湖南畜牧兽医 2018(04)
    • [18].带枣疯病组培苗持续培养中疑似抗病变异株的筛选与鉴定[J]. 南方农机 2020(02)
    • [19].四川省1例脊髓灰质炎疫苗高变异株病例的流行病学调查与分析[J]. 预防医学情报杂志 2016(11)
    • [20].一株携带EGFP基因的重组伪狂犬病毒变异株的构建[J]. 中国动物传染病学报 2015(04)
    • [21].沙棘属植物单性异株雌雄鉴定及方法的研究[J]. 青海师范大学学报(自然科学版) 2012(01)
    • [22].响应曲面法优化兽疫链球菌变异株透明质酸发酵条件的研究[J]. 食品工业科技 2009(06)
    • [23].南宁市朝阳溪污水中诺如病毒GⅡ.4型变异株基因分析[J]. 应用预防医学 2016(01)
    • [24].PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗免疫特性的研究[J]. 中国预防兽医学报 2010(06)
    • [25].动检快讯[J]. 中国动物检疫 2008(01)
    • [26].PRRSV经典株和变异株RT-nPCR鉴别诊断方法的建立[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版) 2016(01)
    • [27].高致病性PRRSV变异株与经典株混合感染的研究[J]. 动物医学进展 2009(03)
    • [28].脊髄灰质炎疫苗Ⅲ型高变异株1例病例的应急处理与思考[J]. 职业与健康 2012(01)
    • [29].PRRSV普通株与变异株鉴别诊断RT-PCR方法的建立与临床应用[J]. 中国兽医学报 2012(03)
    • [30].一例来京就诊脊髓灰质炎疫苗病毒高变异株病例的流行病学调查与分析[J]. 疾病监测 2012(03)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  

    PRV变异株GZDZ2016的分离鉴定与TK基因缺失转移载体的构建
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6