马晗, 秦万长, 付小兵, 杨渝, 郁华亮[1]2003年在《碱性成纤维细胞生长因子对大鼠移植膀胱血管生成的影响》文中研究指明目的探讨外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在大鼠同种异体无血管吻合膀胱移植中促进移植物血管形成的作用。方法将SD幼大鼠膀胱无血管吻合移植至5周龄Wistar大鼠大网膜上并予以免疫抑制治疗作为膀胱移植的动物模型。接受膀胱移植大鼠以抽签法随机分为2组:生理盐水对照组和重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)治疗组,治疗组腹腔注射rh-bFGF,500U/d,对照组腹腔注射等量的生理盐水。膀胱移植术后各组分别于7,14d两个时间段处死大鼠,切取移植膀胱标本。利用计算机图像分析技术观察移植物中血管生成的情况,并作定量指标检测。结果与对照组相比较,rh-bFGF治疗组大鼠移植膀胱组织内的血管的数量明显增加,即7d组由28.6增至93.9个/断面,P=0.0001,14d组由27.1增至78.6个/断面,P=0.0001;血管平均断面面积、平均周长、平均直径各项指标明显增加,其中在血管平均断面面积,即7d组由243.93增至546.06μm2,t=-5.65,P=0.0003,14d组由387.96增至733.92μm2,t=-4.48,P=0.0017。差异均有显着性意义(P<0.05)。结论bFGF可明显增加早期大鼠同种异体无血管吻合移植膀胱组织中的血管形成。
马晗[2]2003年在《碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对大鼠移植膀胱血管生成的影响》文中研究说明目的：探讨外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在大鼠同种异体无血管吻合膀胱移植中促进移植物血管形成的作用。 方法：将Sprague-Dawley(SD)幼大鼠膀胱无血管吻合移植至5周龄Wistar大鼠大网膜上并予以免疫抑制治疗作为膀胱移植的动物模型。将40只接受SD幼大鼠膀胱无血管吻合移植的Wistar大鼠随机分为2组：生理盐水对照组和重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)治疗组，每个实验组再分为0日、7日、14日3个时间组，每组10只(0日组为随机抽取10只SD幼鼠由对照和治疗组共用，直接切取膀胱，不作其它处理)。治疗组腹腔注射rh-bFGF，剂量为500U/d，对照组腹腔注射等量的生理盐水。膀胱移植术后1、2周分别处死治疗组及其对照组各10只大鼠，切取移植膀胱标本固定组织并切片，光学显微镜下观察膀胱上皮、血管、肌肉层。利用组织学、计算机图像分析技术观察移植物中血管生成的情况，并作定量指标检测。 结果：与生理盐水对照组相比较，rh-bFGF治疗组大鼠移植膀胱组织内的毛细血管的数量明显增加(P＜0.05)，血管平均断面面积、平均周长、平均直径各项指标均明显增大(P＜0.05)。 结论：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可明显增加早期大鼠同种异体无血管吻合移植膀胱组织中的血管形成，对改善局部组织血运提高移植物的存活率有重要的意义。
陈伟[3]2010年在《碱性成纤维细胞因子靶向结合胶原支架材料促进膀胱重建的实验研究》文中进行了进一步梳理膀胱发生先天畸形、后天损伤或肿瘤时,往往需要重建修复手术,才能恢复膀胱的结构和功能。在膀胱重建修复术中,人们常用胃肠道作为重建修复材料,但会产生多种并发症,如酸碱代谢紊乱、黏液分泌、逆行感染、结石和恶性肿瘤等。术后,重建的膀胱收缩功能差,容易产生剩余尿增多和排尿困难。如何解决新膀胱收缩力不足和胃肠道粘膜并发症的缺点一直是泌尿外科医生面临的难题。目前,由于缺乏适当的重建材料,胃肠道膀胱成形术依然是膀胱重建修复的金标准。因此,探索新的膀胱重建修复材料,是十分必要的。鉴于此,我们构建一种定向修复功能生物材料,通过基因工程技术,在生长因子bFGF上藕联特异结合胶原材料的胶原结合区(Collagen binding domain, CBD),然后将带胶原结合区的bFGF与胶原支架材料复合,通过CBD的藕联,bFGF就被锚定在胶原支架材料上。该体系具有生物可降解、免疫原性低、靶向释放bFGF的特性,一方面可以以定点、持续的方式提供再生信号分子,同时外源的胶原支架材料也为细胞增殖和组织再生提供了叁维空间。本课题研究包括以下叁个部分:第一部分:CBD-bFGF、NAT-bFGF的蛋白表达、纯化及鉴定。本部分实验通过基因工程技术,分别设计CBD-bFGF和NAT-bFGF蛋白的表达序列,利用pET28a载体进行蛋白表达,Ni柱亲和纯化,将蛋白诱导表达之后,15%SDS-PAGE观察, NAT-bFGF重组蛋白与CBD-bFGF重组蛋白分别在19kD与21kD之间出现了明显的条带,而且二者位置不同,原因是因为带胶原结合区的bFGF(CBD-bFGF)蛋白由于多了一段CBD,所以要比天然的bFGF(NAT-bFGF)大一些。为了能够得到更准确的结果,我们同时做了Western-blotting分析,可以看到在相应的位置出现了两条明显的条带。第二部分:CBD-bFGF和NAT-bFGF的蛋白活检测CBD-bFGF/Collagen和NAT-bFGF/Collagen修复材料的制备。我们选择促进人成纤维细胞增殖的MTT分析实验,来检测表达的蛋白的生物学活性。生长因子CBD-bFGF和NAT-bFGF激成纤维细胞增殖3天后,加入MTT,DMSO溶解后测量OD492值。结果显示,成纤维细胞的增殖速度的指标OD492的高低有明显的剂量依赖效应,随着浓度的增高,细胞的增殖速度也加快,CBD-bFGF和NAT-bFGF组的两条增殖曲线并没有明显的区别。统计结果显示,两组在每个浓度的OD值没有显着的差异,表明CBD-bFGF和NAT-bFGF不仅有活性,而且二者的活性是相近的。我们在检测了生长因子的活性之后,对CBD-bFGF和NAT-bFGF的胶原结合能力进行了分析,以确认CBD-bFGF是否能有效的与胶原结合。我们分别把CBD-bFGF和NAT-bFGF与胶原包被的96孔酶标板结合,再用ELISA方法检测结合量的差异。405nm的吸光度结果提示, CBD-bFGF在胶原蛋白上的残留量要显着多于NAT-bFGF蛋白。这一结果显示了CBD-bFGF的特异胶原结合能力,其胶原结合能力大大提高。将等量的NAT-bFGF和CBD-bFGF分别加载在胶原蛋白上,然后浸泡在PBS中,在不同时间点利用ELISA实验来检测残留在胶原蛋白表面的bFGF含量,从而确定bFGF的释放速度。结果显示,前7天每个时间点CBD-bFGF在胶原膜上的残留量都要显着高于NAT -bFGF,也就是说前者的释放速度明显低于后者,CBD-bFGF在胶原蛋白上具有更好的体外缓释能力。我们将胶原包被到48孔板上,然后加入不同浓度的NAT-bFGF和CBD-bFGF浸泡,1小时后将溶液吸出,PBS洗涤4遍后,将成纤维细胞接种到此48孔板。72小时后,MTT检测成纤维细胞增殖情况。结果提示,在不同的浓度梯度,CBD-bFGF组的成纤维细胞的增殖速度明显高于NAT-bFGF组。统计结果显示,两组在OD值具有显着的差异。表明CBD-bFGF能更长时间维持在胶原蛋白上发挥其生物学作用。第叁部分:CBD-bFGF/ Collagen和NAT-bFGF/Collagen修复材料对大鼠膀胱损伤模型进行重建修复。我们进行了体内功能实验,进一步考察CBD-bFGF活化的胶原功能生物材料对于损伤修复的促进作用。我们选用大鼠膀胱重建修复模型,分PBS/Collagen组、NAT-bFGF/Collagen组、CBD-bFGF/Collagen组及Sham-operated组,30d和90d作为取材观察时向点。结果显示,CBD-bFGF/Collagen组能较好的促进膀胱组织再生,血管化和肌肉化显着高于PBS/Collagen组和NAT-bFGF/Collagen组,尿动力学分析表明,有和Sham-operated组相似的膀胱顺应性,显示了CBD-bFGF/Collagen定向结合修复系统在促进损伤修复,提高修复质量上的巨大作用。综上所述,我们利用基因工程方法,在成纤维细胞生长因子bFGF上耦联能够特异结合的胶原的胶原结合区肽(CBD),结果显示CBD-bFGF在保持生物学活性的同时,能够有效地靶向结合在胶原材料上。在大鼠膀胱重建修复动物模型中,CBD-bFGF/Collagen定向修复材料能够更好地促进膀胱膀胱组织再生和功能恢复,显示了CBD-bFGF/Collagen定向修复材料在膀胱重建中的巨大潜力。本课题探索应用组织工程技术制备膀胱替代材料,为膀胱重建提供新的技术和方法,有广阔的研究价值和临床应用前景。
陈宏贞[4]2009年在《按摩对骨骼肌损伤修复过程中bFGF表达的影响》文中指出目的:碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是对骨骼肌生长发育具有重要生物效应的生长因子,在骨骼肌的生理病理过程中起重要作用。有研究显示bFGF可调节骨骼肌成肌细胞功能,促进骨骼肌成肌细胞的增殖和抑制其分化,在骨骼肌损伤修复过程中起非常重要作用。骨骼肌损伤是运动中最常见的损伤,其治疗方法很多,按摩是安全经济而又行之有效的治疗手段。研究表明,按摩可增加骨骼肌损伤修复过程中肌卫星细胞数目,促进骨骼肌恢复。本研究旨在观察大鼠急性拉伤后腓肠肌bFGF表达的时间规律,以及按摩对骨骼肌损伤修复过程中bFGF表达的影响;探讨按摩治疗骨骼肌损伤的作用机理。方法:雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠21只,分为3大组,每小组各3只:(1)对照组,与自然修复组和按摩治疗组进行比较;(2)自然修复组,与按摩治疗组进行比较:损伤后1h组、2d组、5d组、7d组;(3)按摩治疗组,与自然修复5d组、7d组进行比较:伤后第2d开始按摩,按摩治疗3d组、5d组。采用自制拉伤装置造成大鼠双后肢腓肠肌急性拉伤模型,损伤后第2d进行按摩治疗,并采用免疫组化法和图像分析系统观察大鼠腓肠肌自然修复过程中及按摩后bFGF表达的变化。结果:(1)急性拉伤后1h和2d大鼠腓肠肌bFGF平均光密度值与正常对照组相比显着升高;7d时大鼠腓肠肌bFGF平均光密度值达本实验最大值;(2)按摩治疗3d组大鼠腓肠肌bFGF表达水平较同期自然修复组明显降低,有极显着性差异;按摩治疗5d组与同期自然修复组比较显着降低,有极显着性差异。(3)光镜观察结果显示,按摩后损伤肌肉的炎症反应减轻,肌细胞的坏死减少,瘢痕修复减少,肌细胞再生加快,修复时间缩短。结论:(1)急性拉伤后7d内大鼠腓肠肌bFGF阳性表达呈现上升趋势;(2)推测按摩通过促进bFGF在损伤修复过程中对靶细胞的作用,有效缩短了修复过程,此可能为按摩促进骨骼肌损伤修复的机制之一;(3)按摩可减轻肌肉损伤后的炎症反应,进损伤肌肉组织的修复,缩短修复时间。
马晗, 秦万长, 付小兵, 杨渝, 郁华亮[5]2003年在《碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与膀胱移植》文中提出1 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的生物学效应bFGF 和其他细胞因子一样,是哺乳动物和人体中一种正常而极其微量的物质,是一种广谱的有丝分裂原,具有广泛的细胞增殖效应。bFGF 对广泛来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促增殖作用,其靶细胞有:成纤维细胞、
陈欢[6]2014年在《基于bFGF/ERK信号通路探讨电针对骨骼肌损伤修复的影响》文中认为目的：基于bFGF/ERK信号通路探讨电针对骨骼肌损伤后肌肉修复再生的作用与机制方法：第一部分：电针阿是穴对大鼠腓肠肌损伤早期肌肉修复再生的影响。通过积累性钝挫伤结合动物跑台离心运动的方法建立SD大鼠腓肠肌损伤模型,观察电针阿是穴对大鼠腓肠肌损伤后1d、4d、7d的组织形态学改变以及PCNA、Desmin、bFGF表达的影响,探讨电针阿是穴对大鼠腓肠肌损伤后肌卫星细胞增殖分化的作用与机制；第二部分：电针委中穴与阿是穴对兔急性腰肌钝挫伤修复期肌肉修复再生及bFGF/ERK信号通路的影响。通过钝挫伤的方法建立新西兰大耳兔急性腰肌损伤模型,观察电针委中穴与阿是穴对损伤后1d、4d、7d、14d兔血清CK活性的动态调节,结合损伤后14d兔腰肌肌细胞数量、肌纤维平均横截面积、每肌纤维细胞核数、Ⅰ级肌束膜厚度、组织形态改变等组织学指标的变化,分析比较电针委中穴与阿是穴的作用差异,并且通过观察损伤后14d兔腰肌PCNA、Desmin、ERK1/2的表达变化,结合血清、腰肌以及脊髓中bFGF含量的改变,探讨电针委中穴与阿是穴对兔急性腰肌钝挫伤肌肉修复再生的作用机制；第叁部分：电针阿是穴对应用U0126抑制剂的兔急性腰肌钝挫伤修复期肌肉修复再生及bFGF/ERK信号通路的影响。通过钝挫伤的方法建立新西兰大耳兔急性腰肌损伤模型,应用ERK抑制剂U0126观察电针阿是穴对损伤后1d、14d兔血清CK活性的变化,以及兔腰肌肌细胞数量、肌纤维平均横截面积、每肌纤维细胞核数、Ⅰ级肌束膜厚度、组织形态改变等组织学指标的变化,结合兔腰肌PCNA、Desmin、ERK1/2与bFGF的表达变化,进一步探讨bFGF/ERK信号通路对电针阿是穴促兔腰肌钝挫伤后肌肉修复再生的介导作用。结果：1.电针阿是穴对大鼠腓肠肌损伤早期肌肉修复再生的影响：组织形态学结果显示,损伤后4d电针组腓肠肌炎症细胞浸润有所减轻,肌细胞再生较丰富；损伤后7d电针组结缔组织增生程度低于模型组,且组织形态学损伤评分明显低于模型组(P<0.01)；电针组腓肠肌Desmin与bFGF在损伤后1d均高于模型组(P<0.01,P<0.05),在损伤后4d腓肠肌PCNA、Desmin与bFGF均高于模型组(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。2.电针委中穴与阿是穴对兔急性腰肌钝挫伤修复期肌肉修复再生及bFGF/ERK信号通路的影响：从组织病理切片观察,损伤后14d,模型组肌纤维排列不齐,结缔组织增生明显,再生肌细胞较少,电针委中组肌细胞体积较大,可见肌细胞再生并逐渐融合,结缔组织增生程度较轻,而电针阿是穴组可见较多新生的肌细胞,结缔组织增生程度同样较轻；模型组肌细胞数量MM、肌纤维平均横截面积CSA、每肌纤维细胞核数NPF均明显低于空白组(P<0.05,P<0.01,P<0.01),组织形态学损伤评分以及Ⅰ级肌束膜厚度均明显高于空白组(P<0.01),其中肌纤维CSA、NPF均低于电针委中组(P<0.05,P<0.05)与电针阿是穴组(P<0.05,P<0.05),组织形态学损伤评分以及Ⅰ级肌束膜厚度均明显高于电针委中组(P<0.01,P<0.05)与电针阿是穴组(P<0.01,P<0.05),而电针委中组组织形态学损伤评分低于电针阿是穴组(P<0.05);损伤后1d,模型组、电针委中组与电针阿是穴组血清CK含量均明显高于空白组(P<0.01),在损伤后4d电针委中组与电针阿是穴组均高于模型组(P<0.01,P<0.05),在损伤后7d模型组再次回升明显高于空白组(P<0.01),电针委中组明显低于模型组(P<0.01)与电针阿是穴组(P<0.05),电针阿是穴组低于模型组(P<0.05),在损伤后14d模型组仍明显高于空白组(P<0.05),而电针委中组与电针阿是穴组均低于模型组(P<0.01,P<0.01);损伤后14d,模型组兔腰肌PCNA、ERK1/2以及bFGF的表达均高于空白组(P<0.01,P<0.05,P<0.01),其PCNA、Desmin、ERK1/2以及bFGF的表达均低于电针委中组(P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.01)与电针阿是穴组(P<0.01,P<0.05,P<0.05,P<0.01)；电针委中组兔腰肌PCNA与bFGF的表达低于电针阿是穴组(P<0.05,P<0.01)；模型组兔腰段脊髓bFGF含量高于空白组(P<0.05),并且低于电针委中组(P<0.01);损伤后4d,模型组血清bFGF均高于空白组(P<0.01)、电针委中组(P<0.05)与阿是穴组(P<0.05)；损伤后7d,各组均无统计学差异；损伤后14d,模型组低于空白组(P<0.01),而电针阿是穴组低于电针委中组(P<0.05)。3.电针阿是穴对应用U0126抑制剂的兔急性腰肌钝挫伤修复期肌肉修复再生及bFGF/ERK信号通路的影响：从组织病理切片观察,损伤后14d,模型组肌纤维排列不齐,结缔组织增生明显,再生肌细胞较少。模型抑制组肌细胞缺失明显,肌细胞体积明显减小,仅有少量结缔组织增生。电针组肌纤维排列较整齐,可见较多新生的肌细胞,轻度结缔组织增生。电针抑制组有少量肌细胞再生,较严重的结缔组织增生；模型组组织形态学损伤评分明显高于空白组(P<0.01,P<0.01),低于模型抑制组(P<0.01),电针组均明显低于模型组(P<0.01)与电针抑制组(P<0.01)；模型组肌细胞数量MM、肌纤维平均横截面积CSA、每肌纤维细胞核数NPF明显低于空白组(P<0.05,P<0.01,P<0.01),高于模型抑制组(P>0.05,P<0.01,P<0.05),电针组高于模型组(P>0.05,P<0.05,P<0.05)与电针抑制剂组(P>0.05,P<0.05,P<0.01)；模型组Ⅰ级肌束膜厚度均明显高于空白组(P<0.01)与模型抑制剂组(P<0.05),电针组低于模型组(P<0.05),与电针抑制剂组无显着差异(P>0.05)；模型组血清CK含量高于空白组(P<0.01),与模型抑制剂组无显着差异(P>0.05),电针组低于模型组(P<0.05)与电针抑制剂组(P<0.05)。损伤后14d,模型组兔腰肌PCNA、ERK1/2以及bFGF的表达均高于空白组(P<0.01,P<0.01,P<0.05),模型抑制剂组PCNA、Desmin、ERK1/2的表达均低于模型组(P<0.01,P<0.01,P<0.01),电针组PCNA、Desmin、ERK1/2以及bFGF的表达均高于模型组(P<0.01,P<0.05,P<0.05,P<0.01)；电针抑制剂组PCNA、Desmin、 ERK1/2的表达均低于电针组(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。结论：1.电针阿是穴能促进大鼠腓肠肌损伤早期肌卫星细胞的增殖与分化,并且可能与其上调bFGF的表达有关；2.电针委中穴与阿是穴均能够促进兔腰肌急性钝挫伤修复期肌卫星细胞的增殖、分化以及组织再生修复的成熟度,其机制可能与调节局部组织、血清以及脊髓中bFGF的含量变化有关,ERK1/2信号通路可能是介导电针发挥作用的主要通路之一；3.电针委中穴对兔腰肌损伤的促修复再生作用有优于电针阿是穴的趋势,两者的作用途径可能存在差异：电针委中穴可能主要通过神经-内分泌的整体调节发挥作用,因此能更明显的促进脊髓bFGF的释放,两者的明确机制有待于进一步研究,而电针阿是穴可能主要通过局部机械牵拉刺激发挥作用,因此对局部组织中bFGF的促进调节更明显；4.应用ERK抑制剂U0126可部分阻断电针阿是穴对兔腰肌损伤后肌卫星细胞增殖分化以及肌肉的再生成熟度的促进作用,bFGF/ERK信号通路可能是电针阿是穴促肌肉修复再生的主要途径之一。
刘通[7]2016年在《电针“委中”穴对腰多裂肌卫星细胞增殖及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响》文中提出多裂肌位于脊柱最内侧,是附着面积最大的椎旁肌,由多束组成,从颈部到骶部均有分布。其中腰多裂肌以腰椎的棘突为中心向两侧斜下方辐射,其作用主要是向斜下方牵拉棘突,从而保证腰椎的稳定性。腰多裂肌的损伤、萎缩以及功能紊乱与各种急慢性腰痛的发生密切相关。因此,促进损伤多裂肌的修复和功能重建有非常重要的临床意义。肌卫星细胞(Muscle Satellite Cell, MSCs)属于骨骼肌干细胞,肌肉损伤后,MSCs的激活、增殖和成肌分化与融合是肌肉修复过程中必不可少的环节。生理情况下,MSCs通常处于静止状态,一旦细胞的基膜遭到破坏,便开始激活、增殖、分化、融合成为新生的肌纤维。因此,MSCs的研究对于进一步理解肌肉的损伤修复和发病机制均有重要的价值。近年来,大量关于针刺治疗骨骼肌急慢性损伤的研究已经证实,针刺能促进MSCs增殖高峰期提前,促进肌肉修复,加速损伤愈合进程。“委中”穴属于足太阳膀胱经穴,对腰背部疾病有特异性的疗效,“腰背委中求”是委中穴对腰背部疾病特异性疗效的经验总结。我们前期实验已经证明电针“委中穴”能促进肌肉修复期MSCs的增殖、分化以及组织再生修复的成熟度,加快大鼠损伤多裂肌的再生修复。在前期研究中,我们发现电针“委中”穴在治疗第4天时,对生肌调节因子表达的影响最为显着,在治疗第7天时其表达即出现了下降,说明电针“委中”穴在肌肉恢复初期的作用更为活跃。因此,本研究拟从在体和离体两方面结合观察电针“委中”穴在肌肉恢复初期(4天时)对多裂肌组织的再生修复作用,以及对Pax7、Myod蛋白与PI3K/Akt/mTOR信号通路相关信号分子表达的影响,进一步探求电针“委中”穴对腰部多裂肌损伤后再生修复的作用机制。实验一：电针“委中”穴对腰多裂肌损伤模型大鼠Pax7、Myod表达的影响目的：在体观察电针“委中”穴对大鼠腰多裂肌损伤模型肌肉再生修复的影响。方法：雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、模型对照组、电针“委中”组、电针“肾俞”组,通过布比卡因局部肌肉注射的方法复制大鼠多裂肌损伤模型,电针“委中”组和电针“肾俞”组分别于模型建立后24h开始治疗,1次/日。于治疗第4天取材,HE染色观察各组大鼠腰多裂肌纤维损伤及修复情况,采用Western-blot方法观察各组肌肉组织中Pax7、Myod蛋白的表达。结果：(1)HE染色结果显示：正常组和模型对照组肌纤维细长均匀,排列整齐,纤维与纤维之间间隙匀称,细胞核均匀排列在肌细胞周围,模型对照组偶见细胞间质轻微水肿。模型组可见肌纤维广泛变性样坏死,巨噬细胞浸润明显,偶见未受损纤维束。电针“委中”组和电针“肾俞”组已经出现肌纤维的再生,纤维直径较大,已有部分细胞核向细胞周围迁移。(2) Western-blot结果显示,模型组Myod蛋白表达与正常组和模型对照组之间无显着性差异(P>0.05),电针“委中”组和电针“肾俞”组Myod蛋白表达优于其余叁组(P<0.05),而电针“委中”组略优于电针“肾俞”组(P<0.05)。各组之间Pax7蛋白表达均无显着性差异(P>0.05)。结论：(1)电针“委中”穴和电针“肾俞”穴均能明显提高损伤局部Myod的表达,促进MSCs的成肌与分化；而对Pax7的表达无明显促进作用,可能与电针在促进成肌分化初期,细胞持续高表达Myod,却下调了Pax7蛋白的表达有关。(2)电针“委中”穴在损伤早期促进肌肉修复的作用略优于电针“肾俞”穴。实验二：单根肌纤维法分离培养大鼠多裂肌MSCs及鉴定目的：应用单根肌纤维法分离培养大鼠多裂肌MSCs并进行鉴定。方法：取大鼠1只,麻醉致死后,分离多裂肌,应用单根肌纤维法分离出单个MSC,并进行诱导分化,分别通过MSCs增殖与分化期不同的肌肉相关特异性标志蛋白进行鉴定。结果：(1)形态学观察：原代细胞经消化后,显微镜下观察,细胞呈圆形,高折光性。重新接种后12h,细胞大部分已经贴壁,伸展为长梭形或纺锤形,接种后3天,细胞明显增殖,接种后5天,MSCs开始出现方向性排列,接种后8天,MSCs方向性更加明显,并且有多核肌管形成。(2)免疫荧光鉴定：Pax7、Myod在MSCs增殖过程中核表达均为阳性。以含10μMIGF-1和2%马血清的分化培养基成肌诱导后,可出现肌管,Desmin在分化初期细胞质中表达为阳性。细胞贴壁7天后,不经诱导也可有肌管形成。结论：应用单根肌纤维法可以成功分离大鼠腰多裂肌MSCs, MSCs相关特异性标志物表达为阳性,经过成肌诱导,分离出的MSCs有分化为肌管的能力。实验叁：电针血清对MSCs增殖及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响目的：体外观察电针血清对MSCs增殖及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响。方法：实验一中正常组、模型组、电针“委中”组、电针“肾俞”组在取材后分别获取各组血清,将不同处理组的血清分别加到实验二分离并鉴定过的多裂肌MSCs中共同培养,电针“委中”血清组和电针“肾俞”血清组分别于加血清前2h加入P13K抑制剂LY294002,干预24h后,分别采取CCK-8、Edu检测电针血清对MSCs增殖能力的影响,同时采取Western-blot和RT-PCR的方法检测Pax7、Myod以及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关信号分子蛋白和mRNA的表达。结果：(1)CCK-8结果显示,与空白组相比,正常血清组、模型血清组、电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组OD值明显增加(P<0.01),模型血清组OD值优于正常血清组(P<0.01),电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组OD值优于模型组(P<0.01),加用LY294002后,电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组OD值明显下降(P<0.01),电针“委中”血清组OD值与电针“肾俞”血清组之间无显着性差异(P>0.05)。(2)Edu结果显示,模型血清组、电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组中Edu阳性细胞比例明显优于正常血清组(P<0.05,P<0.01,P<0.01),电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组优于模型血清组(P<0.01,P<0.05),加用LY294002后,电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组Edu阳性细胞比例明显下降(P<0.01,P<0.05),电针“委中”血清组与电针“肾俞”血清组之间无显着性差异(P>0.05)。(3) Western-blot结果显示,各组之间Pax7蛋白表达无显着差异；Myod蛋白表达模型血清组高于正常血清组(P<0.05),电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组优于模型血清组(P<0.05,P<0.01),电针“委中”与电针“肾俞”血清组之间无显着性差异(P>0.05),LY294002明显下调电针“委中”与电针“肾俞”血清组Myod的表达(P<0.05,P<0.01)；p-Akt表达模型血清组优于正常血清组(P<0.05),电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组优于模型血清组(P<0.01,P<0.05),电针“委中”与电针“肾俞”血清组之间无显着性差异(P>0.05), LY294002明显下调电针“委中”与电针“肾俞”血清组p-Akt的表达(P<0.01, P<0.01)。p-mTO R表达模型血清组高于正常血清组,电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组与模型血清组之间无显着性差异(P>0.05)。(4)RT-PCR结果显示,各组之间Pax7及Myod基因的mRNA表达均无显着差异,与Western-blot结果相反,模型血清、电针“委中”血清、电针“肾俞”血清Pax7、Myod的基因表达均有低于正常血清的趋势,与抑制剂组相比,电针“委中”血清、电针“肾俞”血清Pax7、Myod的基因表达也出现了降低的趋势。结论：(1)电针“委中”血清和电针“肾俞”血清均可促进MSCs的增殖,且有促进成肌分化的趋势,与PI3K/Akt通路有关,但电针血清对Pax7、Myod基因表达的规律仍需进一步的研究。(2)电针“委中”与电针“肾俞”穴的效应机制除血清途径外,可能还存在其他的作用途径。
史学形, 李青[8]2013年在《外源性bFGF、VEGF对大鼠脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖分化影响的实验研究》文中研究指明目的制备大鼠脊髓损伤模型,研究外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)联合移植对内源性神经干细胞(ENSCs)是否具有促增殖分化作用。方法成年Wistar大鼠56只,随机分成四组:A组为生理盐水组(n=14);B组为bFGF组(n=14);C组为VEGF组(n=14);D组为bFGF、VEGF组(n=14)。用Allen法在T10节段制备大鼠脊髓损伤模型,损伤后立即分别给予生理盐水、bFGF、VEGF、bFGF和VEGF。术后各时间点BBB评分系统监测大鼠运动功能的恢复,并在术后21d取材,处死前24h腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu),取损伤部位近远端各5mm脊髓组织,行HE染色,免疫组织化学法检测Brdu、巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达情况。结果 (1)损伤后21d,bFGF、VEGF合用治疗组BBB高于其它叁组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)损伤后21d时,bFGF、VEGF治疗组组织形态学基本接近正常脊髓组织。(3)免疫组织化学结果:损伤后21d时,bFGF、VEGF治疗组,神经干细胞数量和神经元数量明显高于其它组(P<0.05)。结论联合移植外源性bFGF、VEGF对ENSCs增殖和向神经元方向分化具有促进作用,且二者具有协同作用。
佚名[9]2003年在《《解放军医学杂志》2003年(第28卷)主题词索引 (按汉语拼音字母顺序排列)》文中指出数字和字母9 顺维甲酸 9 顺维甲酸对肺鳞癌细胞生长、分化及凋亡的作用 (张世国等 ) 2 8(1) :731 型人免疫缺陷病毒 中国汉族人SDF1 β编码区新多态性位点初步研究 (刘明旭等 ) 2 8(4 ) :30 5Caspase 1 Caspa
王心华[10]2014年在《不同细胞生长因子在皮瓣坏死创面愈合中作用和机制研究》文中认为背景皮瓣手术是整形重建和口腔颌面部手术中最重要的技术之一。然而,无论是在实验还是临床中,外科皮瓣坏死都是很难完全预防和避免的。皮瓣坏死往往导致皮瓣摘除。很多的研究都尝试通过药物,提高皮瓣成活率。然而,在这些研究中也有明显的一些不足。许多研究中没有动物模型解剖学证据；当坏死即将发生时,没有很好的解决方法；虽然一直对坏死的预防性研究很多,但关于促进坏死修复的研究很少,对皮瓣坏死创口治疗的研究更为鲜见。KGF、EGF和VEGF是生长因子领域研究最多的几个生长因子,大量的文献都确定其分别特异性对上皮细胞、主要对上皮细胞、特异性对血管内皮细胞有很强的生长促进作用。KGF对上皮细胞的特异性作用,使其能促进上皮细胞增殖的同时,不促进纤维生长,不导致疤痕形成,成为促进上皮创口愈合最好的候选。EGF是临床上应用最多的生长因子之一,其对上皮的促进作用得到很多患者及医生的认同。VEGF是迄今为止发现的促进血管新生最有效的生长因子,能够极大地提高外科皮瓣的成活,预防皮瓣坏死。皮瓣坏死的基因预防及治疗是一种极有潜力的方法,是未来研究的发展方向。当今皮瓣的基因研究主要是以生长因子作为治疗性基因完成的。如何以最佳的方法将外源性DNA导入皮瓣,使细胞接收并表达外源DNA,一直是值得大家研究和探讨的问题。我们以腺病毒为载体(Ad),携带角化细胞生长因子(KGF)基因的方法,利用复制缺陷型腺病毒载体重组KGF基因,通过其强感染能力与转基因能力,在体外体内特异性表达有活性的KGF蛋白,发挥定向修复组织损伤的作用。另外我们直接在大鼠背部的坏死皮瓣区域中和皮肤中注入EGF和VEGF,观察联合应用生长因子是否会对皮瓣区坏死愈合起作用。方法1.Pac Ⅰ核酸内切酶酶切鉴定腺病毒质粒,测序检测是否质粒存在变异。Pac Ⅰ核酸内切酶酶切pAd-KGF,线性化后的pAd-KGF转染进HEK293(293)细胞后,制备Ad-KGF。应用293细胞扩增、纯化得到Ad-KGF病毒。应用于后续细胞及动物实验,并观察病毒转染293细胞后,细胞形态及病毒的感染能力。2.Ad-KGF感染正常细胞系PA317,HUVEC,HaCaT,和293细胞后,观察病毒的感染的能力；提取受感染细胞的RNA,逆转录得到cDNA后,进行半定量PCR和荧光定量PCR,检测细胞内KGF的表达水平；通过ELISA,检测受感染细胞上清中KGF的表达水平；通过划痕实验模仿伤口,培养HaCaT细胞48小时,确定KGF对上皮细胞生长迁移的作用；将PA317细胞,HUVEC细胞和HaCaT细胞接种于Transwell小室,293细胞+Ad-KGF转染24小时(293+Ad-KGF),293细胞+Ad转染24小时(293+Ad),HaCaT,293细胞和293细胞+KGF(293+KGF)接种于下室内,观察KGF和Ad-KGF对成纤维细胞系,血管内皮细胞系和上皮细胞系的生长迁移作用。3.我们首先解剖大鼠背部,研究确定大鼠背部血管走行。在传统大鼠背部皮瓣模型上,改良手术及实验过程,使皮瓣发生坏死。记录大鼠的体重,皮瓣坏死面积和愈合情况。在术后第15天,25天,和45天过量水合氯醛处死大鼠,取背部坏死皮瓣标本,进行组织化学染色分析。4.在建立大鼠背部皮瓣模型之后,所有动物分为四组。将1ml PBS+dexamethasone(DXM),1ml PBS+Ad-KGF+DXM,or1ml PBS+Ad+DXM分别注入大鼠背部皮瓣坏死区皮下和创口边缘,分别于术后5天,10天,20天,和30天注射相同的药物。隔日记录体重,直至创面坏死愈合。术后第15天,25天,和35天过量水合氯醛处死大鼠,取背部坏死皮瓣标本,进行组织化学Masson染色、免疫组化染色分析和荧光定量PCR分析,上皮及上皮下组织的生长情况,上皮的生长厚度,取血清进行ELISA检测KGF表达水平。5.首先通过细胞迁移实验确定EGF和VEGF对PA317,HUVEC,和HaCaT细胞迁移的活性。建立大鼠背部皮瓣模型,坏死发生后,沿创口边缘及坏死皮下注入1ml PBS+EGF (150mg/kg),1ml PBS+VEGF (10μg), or1ml PBS+EGF (150μg/kg)+VEGF(10μg)。隔日记录体重并注射相同的药物,直至创面坏死愈合。术后第15天和25天过量水合氯醛处死大鼠,取背部坏死皮瓣标本,进行组织化学Masson染色和免疫组化染色分析创缘上皮及上皮下组织的生长情况,上皮的生长厚度,并取血清进行ELISA检测。结果1.酶切鉴定结果与设计和文献相符,证明载体pAd-KGF构建正确。pAd-KGF质粒测序结果显示起始位点：第185bp,ATG。终结位点：第679bp,TAA。全序列对比小鼠KGF基因序列,二者完全匹配,不存在突变。病毒转染正常293细胞24小时,开始出现细胞变圆；荧光显微镜镜下观察,部分293细胞开始表达大量荧光蛋白。转染第96小时后,所有293产生细胞病理效应,显微镜下观察所有细胞呈圆球形葡萄样改变,漂浮于培养液中,荧光显微镜镜下观察293细胞呈圆球形,表达大量荧光蛋白。重组腺病毒Ad-KGF和Ad在293细胞内大量扩增,并收集后。测得Ad-KGF病毒的效价滴度为2×1011PFU/ml,Ad病毒的效价滴度为3×1012PFU/ml。2.pAd-KGF为构建腺病毒质粒。半定量PCR证明pAd-KG内存在KGF表达基因。经过基因重组后的腺病毒Ad-KGF具有感染正常细胞,于正常细胞内表达KGF的能力。正常的293细胞不能表达KGF的mRNA,PA317细胞能分泌KGF,表达KGF mRNA。Ad-KGF感染293细胞后,细胞成功表达KGF mRNA,而在293细胞和293+空病毒Ad内不能表达KGF mRNA。通过ELISA检测培养液上清中外分泌的KGF含量。检测证明Ad空病毒转染细胞后48小时,上清液中不分泌KGF蛋白,而Ad-KGF转染细胞的后的48小时,细胞培养上清中能够检测到大量的KGF表达,且浓度随着Ad-KGF的滴度增加而增加。通过划痕实验,证明在KGF作用下,HaCaT上皮细胞的迁移能力显着增加。而对照组细胞开始出现凋亡现象。Transwell细胞迁移实验证明KGF能有效促进HaCaT上皮细胞生长迁移,而对HUVEC血管内皮细胞作用不明显,对PA317成纤维细胞没有明显作用。3.大鼠背部七条静脉和一侧有超过二十条动脉分布。手术后叁天,大鼠的体重会稍有下降,然后稳定上升。PBS组和空白组中坏死面积在9天内达到最高峰。从9至47天中,坏死面积逐渐减少,在47天坏死几乎完全愈合。组织病理检查中,可见术后15天,坏死创口边缘上皮细胞增生明显,有少量纤维成分生成,创口愈合区有大量小脉管形成和大量不成熟的纤维成分形成。至第35天,上皮增生修复较前明显弱,但较正常上皮,厚度仍明显增大。4.成功建立大鼠背部皮瓣坏死模型后,四组动物术后体重均有轻度下降,从第叁天开始,体重逐步上升,其中以DXM组的体重上升最明显。术后第五天,坏死成活区域分界清晰。术后第十天,坏死面积达到最大。随着不同药物的治疗,坏死面积在各组间都明显下降,且Ad-KGF组坏死面积缩小最为明显。Masson染色显示术后15天,四组坏死创口边缘上皮都明显增生,其中Ad-KGF组上皮细胞增生最多。术后35天,Ad-KGF组坏死伤口已经愈合,而其它叁组还有较大的坏死面积。术后15天和25天,上皮细胞厚度在Ad-KGF组增生最为明显,术后35天上皮厚度与其它组间没有大的差异。免疫组织化学分析显示,只有在Ad-KGF组的上皮和间充质细胞中有强阳性的KGF表达,而其它叁组均为阴性。Anti-CD34免疫组织化学染色显示四组的小血管生成数目相当5.PA317在EGF, VEGF, VEGF+EGF,或PA317作用下,没有显着性的生长差异。HUVEC对VEGF表现出明显生长加速,在EGF和VEGF联合作用下,生长更加明显,而与PA317共培养时,也有少量生长改变。HaCaT细胞在EGF和VEGF+EGF联合作用下都是表现出生长迁移能力提高。建立动物模型后,分组如下:PBS, EGF, VEGF, EGF+VEGF。四组动物术后体重均有轻度下降,从第叁天开始,体重逐步上升,其中以EGF组的体重上升最少。随着不同药物的治疗,坏死面积在各组间都明显下降,且VEGF+EGF组坏死面积缩小最为明显。术后15天和25天,Anti-CD34免疫组织化学染色显示EGF,VEGF和VEGF+EGF组的小微血管生成数目相当,都显着高于PBS组。结论1. pAd-KGF经过酶切鉴定和测序鉴定具有KGF完全匹配的基因组。成功构建Ad.KGF和Ad,且具有感染细胞的能力。Ad.KGF和Ad经过扩增纯化的滴度为2×1011PFU/ml和3×1012PFU/ml,可以满足细胞及大鼠皮瓣实验的要求。2. Ad-KGF和Ad可以高效转染PA317、HUVEC和HaCaT细胞,并在转染后高效表达活性KGF、KGF可有效促进HaCaT细胞生长,而对PA317、HUVEC细胞作用不明显。3.本实验在确定大鼠背部血供系统基础上,设计形成一套简便且易于推广的手术和皮瓣坏死模型流程,成功建立了稳定的大鼠背部皮瓣坏死伤口模型,可以进行皮瓣坏死为目的基因或药物实验研究。4.使用高表达KGF的腺病毒重组局部转染大鼠背部皮瓣坏死伤口,能有效促进坏死伤口的愈合。5. EGF-VEGF联合应用能促进改良大鼠背部坏死创面愈合。
参考文献：
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[9]. 《解放军医学杂志》2003年(第28卷)主题词索引 (按汉语拼音字母顺序排列)[J]. 佚名. 解放军医学杂志. 2003
[10]. 不同细胞生长因子在皮瓣坏死创面愈合中作用和机制研究[D]. 王心华. 浙江大学. 2014
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