新型线粒体和溶酶体探针用于细胞器稳态的研究

论文摘要

线粒体和溶酶体都是维持细胞稳态的重要细胞器。线粒体膜电势对线粒体功能和细胞性能至关重要。线粒体膜电势的丧失或衰减往往会导致ROS水平上调、细胞自噬和细胞死亡等。因此,研究不同应激状态下线粒体膜电势的变化,对于理解线粒体膜电势在不同生理过程和各种疾病中起到的作用至关重要。溶酶体是细胞内一种酸性细胞器,内含多种酸性水解酶,是细胞内重要的废物处理系统。溶酶体内各参数,如pH,定位,数量和体积,在细胞应激或各种疾病过程中都会发生显著的变化。因此,在应激条件下对溶酶体内各参数的变化进行成像和跟踪,对于我们研究溶酶体稳态相关的生物过程具有重要的意义。本论文共分为三个章节。第一章首先介绍了线粒体膜电势对细胞器稳态的生物学意义,以及当前研究线粒体膜电势方法的优缺点。接着介绍了Staudinger反应在设计生物正交探针用于生物成像领域的研究进展。最后介绍了溶酶体的生物学功能和可用于溶酶体成像的荧光探针。第二章中我们设计了一种无荧光的探针AZF-TPP,可由Staudinger反应介导生成阴离子荧光探针（F-TPP）,从而实现对线粒体的荧光“开关型”成像。与传统的阳离子“常亮”型线粒体荧光探针相比,这种细胞器导向的生物正交成像方法能够有效地辨别正常和不同应激状态下线粒体膜电势的变化。AZF-TPP具有较高的灵敏度和选择性,为实时监测线粒体的动态变化提供了新的研究视角。第三章中我们研究并合成出一种具有良好光稳定性的荧光分子ROXSA,可以在溶酶体内pH变化的情况下稳定地保留在溶酶体中。与当前广泛使用的易于从应激溶酶体中消散的荧光探针不同,ROXSA能够通过随机光学重构显微镜的超高分辨成像长期跟踪应激溶酶体（0-120h）,揭示了随时间推移的溶酶体动态变化、溶酶体在线粒体自噬过程中的动态融合和分裂以及线粒体被溶酶体吞噬的过程。

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第一章绪论

1.1 线粒体

1.1.1 线粒体结构和膜电势

1.1.2 荧光探针法分析线粒膜电势

1.1.3 定量分析线粒膜电势

1.2 生物正交反应

1.2.1 Staudinger反应

1.2.2 Staudinger反应在探针设计领域的研究进展

1.3 溶酶体

1.3.1 溶酶体的结构与功能

1.3.2 溶酶体功能障碍与疾病的关系

1.3.3 溶酶体荧光探针的研究进展

1.4 本工作的研究目标及主要内容

第二章生物正交反应用于线粒体稳态的研究

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 实验仪器

2.2.2 实验试剂

AzF-TPP、^AzF和PPh₃-TPP的合成'> 2.2.3 化合物F-TPP、^AzF-TPP、^AzF和PPh₃-TPP的合成

2.2.4 检测体外Staudinger反应的产物F-TPP

2.2.5 线粒体膜电势介导的Staudinger反应在细胞内成像

2.2.6 F-TPP和传统的线粒体探针的比较分析

2.2.7 利用F-TPP分析不同生化试剂对线粒体膜电势的影响

AzF-TPP和PPh₃的细胞毒性'> 2.2.8^AzF-TPP和PPh₃的细胞毒性

2.2.9 F-TPP的光稳定性

2.3 实验结果与分析

AzF-TPP产生荧光'> 2.3.1 Staudinger反应介导^AzF-TPP产生荧光

2.3.2 Staudinger反应对线粒体的特异性荧光标记

3'> 2.3.3 Staudinger反应对线粒体的荧光标记依赖于PPh₃

AzF-TPP'> 2.3.4 Staudinger反应对线粒体的荧光标记依赖于^AzF-TPP

2.3.5 Staudinger反应对线粒体成像的时间稳定性

2.3.6 Staudinger反应介导的线粒体成像的细胞毒性研究

2.3.7 利用Staudinger反应监测线粒体膜电势的变化

2.3.8 利用Staudinger反应监测细胞应激的线粒体膜电势变化

2.4 小结

第三章非酸性溶酶体保留机制的超分辨成像探针用于溶酶体稳态的研究

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 实验仪器

3.2.2 实验试剂

ROXSA的结构'> 3.2.3 化合物^ROXSA的结构

ROXSA对溶酶体进行荧光标记'> 3.2.4 利用^ROXSA对溶酶体进行荧光标记

3.2.5 ROX和5-ROX均无法对溶酶体进行染色

ROXSA对溶酶体的荧光标记和保留情况分析'> 3.2.6^ROXSA对溶酶体的荧光标记和保留情况分析

ROXSA在溶酶体内富集的机制'> 3.2.7 讨论^ROXSA在溶酶体内富集的机制

ROXSA在线粒体自噬过程中对溶酶体的染色和保留情况分析'> 3.2.8^ROXSA在线粒体自噬过程中对溶酶体的染色和保留情况分析

ROXSA对溶酶体进行超分辨成像'> 3.2.9 用^ROXSA对溶酶体进行超分辨成像

ROXSA的细胞毒性'> 3.2.10 分析^ROXSA的细胞毒性

ROXSA的pH滴定'> 3.2.11^ROXSA的pH滴定

3.3 实验结果与分析

ROXSA对溶酶体的特异性成像'> 3.3.1^ROXSA对溶酶体的特异性成像

ROXSA成像的影响'> 3.3.2 评估溶酶体酸度对^ROXSA成像的影响

ROXSA在溶酶体内积累的细胞途径'> 3.3.3 探索^ROXSA在溶酶体内积累的细胞途径

ROXSA的光稳定性和细胞毒性'> 3.3.4 探究^ROXSA的光稳定性和细胞毒性

ROXSA对线粒体自噬过程进行成像分析'> 3.3.5 利用^ROXSA对线粒体自噬过程进行成像分析

ROXSA对溶酶体进行超分辨率成像'> 3.3.6 利用^ROXSA对溶酶体进行超分辨率成像

3.4 小结

第四章结论与展望

参考文献

硕士期间科研成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王思宇

导师: 韩守法

关键词: 细胞器稳态,荧光探针,超分辨成像

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 厦门大学

分类号: Q244

总页数: 99

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