转录因子NbNAC1调控植物系统性抗性防御病毒入侵的机制及其蛋白抗体制备

论文摘要

在植物面对不断变化的环境中,基因表达调控网络几乎参与了所有的过程。转录因子是调节基因表达水平的关键,而NAC转录因子是植物特有的转录因子,能够参与调控植物多种生物过程。但是有关NAC转录因子调控植物激素信号传导途径来应答病毒入侵的机制还很不清楚。我们研究了本生烟NbNAC1转录因子调控植物激素信号传导途径来应答病毒入侵的机制。首先我们通过RT-PCR的方法成功从本生烟中克隆得到NbNAC1的全长序列。系统发生进化树构建的结果表明,NbNAC1与抗逆反应相关的转录因子番茄S1NAC1和辣椒CaNAC1的亲缘关系最近。共定位实验表明NbNAC1定位于细胞核,酵母单杂交实验证明了其C端具有转录激活活性。荧光定量PCR结果表明,烟草花叶病毒（TMV）侵染本生烟后能够诱导NbNAC1基因的表达。然后我们利用病毒诱导的基因沉默技术将NbNAC1的表达成功抑制后接种TMV。和对照相比,沉默NbNAC1的植株中病毒大量积累,并且沉默植株中活性氧爆发。说明抑制NbNAC1的表达,植物的系统性抗性减弱。进一步研究表明,沉默NbNAC1的植株,水杨酸（SA）含量显著下降,SA合成与信号途径关键酶基因MbICS1、NbNPR1、以及SA介导的防御基因NbPR1、NbPR2、NbPR5的表达显著下调。之后同时缺失SA和NAC信号,研究植物系统性抗性是否发生变化。在接种TMV后,同时缺失SA和NAC信号的植株中病毒大量积累,活性氧爆发,植物变得对TMV超级敏感,丙二醛和电导率的结果也表明细胞膜损伤更为严重,说明植物的系统性抗性进一步显著减弱。另外利用水杨酸处理缺失NAC信号的植株,结果显示可以部分地恢复由于缺失NAC信号所丢失的抗性。因此我们认为,NbNAC1转录因子在调控植物系统性抗性防御病毒入侵过程中起重要作用,可能调控SA信号途径应答病毒入侵。该研究为利用基因工程原理改良农作物的抗逆性,培育优良品种,增强植物对病原菌的抵抗力提供重要的理论依据。为了更深入研究转录因子NbNAC1在激素信号网络中作为关键调控因子的调控作用,探索NbNAC1与水杨酸信号转导途径蛋白质互作模式,有必要通过DNA重组技术获得NbNAC1重组蛋白并制备血清抗体。原核表达系统能够便捷高效地获得目的蛋白,因此构建高效的表达体系是获得NbNAC1蛋白的关键。我们选择了两种标签的表达载体,成功构建了 pET28a-NbNAC1和 pGEX-4T-1-NbNAC1 载体,利用 E coil Rosetta（DE3）菌株进行表达。通过对诱导条件探索,我们发现两种载体都是在37℃、1mMIPTG诱导条件下表达量最大。经SDS-PAGE电泳检验,pGEX-4T-1-NbNAC1载体表达的蛋白是可溶性蛋白,主要集中在上清中可以直接用GST介质纯化。而pET28a-NbNAC1载体表达后形成包涵体蛋白,主要集中于沉淀中,我们利用包涵体复性技术,成功制备NbNAC1蛋白。将蛋白乳化处理后,直接对大白兔进行注射,获得血清抗体,经Westernb1ot检测,获得的血清抗体具有较高效价,可以用于后续实验。本研究探索了两套解决原核表达包涵体蛋白问题的方案,成功纯化出NbNAC1蛋白并制备出血清抗体,为后续研究NbNAC1与SA互作奠定基础,也为原核表达体系中包涵体问题的解决提供新的策略。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 周杨开

导师: 朱峰,莫渟

关键词: 转录因子,系统性抗性,水杨酸,原核表达,抗体制备

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 扬州大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000862

总页数: 76

文件大小: 8188K

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