内质网N-糖基化相关蛋白的拓扑学和GPI重塑相关基因的研究

论文摘要

高等生物细胞表面存在多样的糖缀合物,它们和各个生理过程息息相关。因此,对糖基化修饰途径中参与糖缀合物合成的相关蛋白或基因的分子机制研究至关重要。其中,蛋白质的N-糖或GPI锚修饰是普遍存在且高度保守的,均起始于内质网（ER）上。在N-糖基化过程中,多萜醇寡糖前体DLO（Dolichol-Linked Oligosaccharide）的生物合成开始于内质网的胞质侧,结束于腔内侧,最终生成由14个单糖组成的Glc3Man9GlcNAc2-PP-Dol。胞质侧DLO的装配分别由两种功能不同的异聚糖基转移酶GTase（Glycosyltransferase）复合物负责。甘露糖基转移酶MTase（Mannosyltransferase）Alg1分别和Alg2、Alg11蛋白相互作用形成多酶复合物,依序催化五个甘露糖的添加,产生Man5GlcNAc2-PP-Dol中间体。尽管Alg1蛋白（Alg1p）在MTases的形成中发挥了核心作用,但它的拓扑信息,比如膜结合的分子机制,仍然知之甚少。结合生物信息学和分子生物学等分析方法,本文对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的Alg1p进行了结构和功能研究。通过表型回补实验在GAL1pr-ALG1酵母菌株中检测Alg1p及其变体的体内酶活,并利用基于LC-MS的测定方法进一步验证其体外活性。在软件预测模拟中,Alg1p与Alg13/14复合体具有结构相似性,可被定义为膜结合型的GT-B糖基转移酶。本文提供了有力的论据证明,N端跨膜结构域（TMD）、位于TMD下游的连续正电荷氨基酸残基和蛋白质表面的两亲性Nα3螺旋结构域,三者共同并严格协调Alg1p在ER膜上的定位和朝向。Alg1p的详细膜拓扑结构进一步揭示了其协调ER胞质侧DLO合成的生物学意义。酿酒酵母Alg2蛋白（ScAlg2p）的拓扑结构在十年前已被解析,但人Alg2蛋白（hAlg2p）的跨膜预测和ScAlg2p截然不同,因此本研究旨在解析hAlg2p的拓扑结构。预实验中,蛋白免疫印迹和免疫荧光技术检测到hAlg2p在HEK293细胞中定位于ER。hAlg2p的跨膜预测和螺旋投影分析表明,hAlg2p的唯一疏水性区域位于85-104位氨基酸之间,是具有两亲性倾向的α螺旋。本文利用分子生物学实验方法,进一步对hAlg2p的膜拓扑结构进行了分析,并证明:hAlg2p的N端和C端均朝向内质网胞质侧;hAlg2p的两亲性α螺旋是参与ER膜结合的唯一位点。相比ScAlg2p,hAlg2p更简单的膜拓扑结构使得它的体外活性不依赖脂质的参与,且催化效率更高。此外,本文建立的TrxAhAlg2活性测定体系,可用于鉴定ALG2-CDG（Congenital Disorders of Glycosylation）病人相关突变体的体外活性。在酿酒酵母中,GPI锚定蛋白的合成起始于内质网,在进一步转运到高尔基体之前,其脂质部分会经历重塑,其中PER1,GUP1和CWH43基因编码的蛋白参与GPI脂质重塑。本文聚焦于甲醇营养型酵母Ogataea minuta中潜在的GPI重塑途径。O.minuta中的PER1,GUP1和CWH43同源基因与酿酒酵母中的对应基因具有功能相容性。在非正常条件下,O.minuta中GUP1或CWH43的敲除会导致其生长缺陷。O.minuta的per1Δ突变体表现出比gup1Δ或cwh43Δ突变体更脆弱的表型。为了进一步了解GPI修饰在O.minuta中的作用,本文以Gas1p在O.minuta中的同源物作为GPI锚定的模式蛋白,研究了这些突变对其加工和定位的影响。在酿酒酵母中,Gas1p是一种大量表达且为人所熟知的GPI锚定蛋白。本文发现O.minuta拥有两个拷贝的GAS1基因,定义为GAS1A和GAS1B。荧光显微镜和免疫印迹分析显示,Gas1Ap和Gas1Bp在per1Δ或gup1Δ突变体细胞中呈现错误定位,且膜部分的含量减少,表明了GPI的脂质重构对O.minuta中GPI锚定蛋白的重要性。本研究首次揭示了在O.minuta细胞中与GPI脂质重塑相关基因的存在。

论文目录

摘要

Abstract

缩略词索引表

第一章绪论

1.1 糖的简述

1.2 N-糖基化

1.2.1 多萜醇寡糖前体（DLO）的合成

1.2.2 DLO合成相关基因的概述

1.2.3 Alg相关糖基转移酶的拓扑学现状

1.2.4 膜蛋白拓扑学研究方法的概述

1.3 GPI锚定蛋白

1.3.1 酿酒酵母细胞中GPI锚定蛋白的合成

1.3.2 GPI锚定蛋白脂质重塑的重要性

1.3.3 甲醇营养型酵母Ogataea minuta的研究现状

1.4 立题依据和研究意义

1.5 本论文的主要研究内容

第二章 β-1,4 甘露糖基转移酶Alg1 的结构和功能分析

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌株和质粒

2.2.2 试剂和仪器

2.2.3 培养基

2.2.4 实验溶液

2.2.5 酵母基因组提取

2.2.6 质粒的构建

2.2.7 酵母转化

2.2.8 荧光定位

2.2.9 酵母点板实验

2.2.10 酵母蛋白的提取

2.2.11 蛋白质免疫印迹Western blot

2.2.12 PNGase F处理

2.2.13 重组蛋白表达和纯化

2.2.14 体外活性反应体系

2.2.15 LC-MS检测

2.3 结果与讨论

2.3.1 Alg1p和异源二聚体Alg13/14 糖基转移酶的结构比对

2.3.2 Alg1N32-GFP融合蛋白的定位分析

2.3.3 Alg1p的 N端在内质网上的朝向分析

2.3.4 Alg1p的 N端去除对酵母细胞生长的影响

2.3.5 Alg1NΔ40 在细胞中的蛋白分布

2.3.6 Alg1p中两亲性α螺旋的研究

2.3.7 Alg1NΔ40-mut6A突变体的体外活性测定

2.3.8 Alg1NΔ32 额外的体外活性分析

2.3.9 Alg1p的拓扑模型

2.4 本章小结

第三章人源Alg2 蛋白的拓扑学研究和体外活性分析

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 培养基、细胞株和质粒

3.2.2 试剂和仪器

3.2.3 实验溶液

3.2.4 质粒的构建

3.2.5 逆转录病毒的包装和细胞稳定转染

3.2.6 免疫荧光

3.2.7 蛋白提取和蛋白质免疫印迹

3.2.8 荧光保护实验（FPP）

3.2.9 重组蛋白表达和纯化

3.2.10 体外活性体系

3.3 结果与讨论

3.3.1 人Alg2 蛋白（hAlg2p）的拓扑结构初步预测

3.3.2 hAlg2p在 HEK293 细胞中的定位

3.3.3 hALG2-KO敲除型细胞株的构建

3.3.4 hAlg2p在内质网上的朝向分析

3.3.5 hAlg2p中两亲性α螺旋的研究

3.3.6 TrxA-hAlg2 的表达纯化和体外活性测定

3.3.7 hAlg2-mut4A突变体的体外活性研究

3.3.8 ALG2-CDG相关突变体的体内表达和体外活性研究

3.4 本章小结

第四章 O.minuta中 GPI锚重塑相关基因的研究

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌株和质粒

4.2.2 试剂和仪器

4.2.3 培养基

4.2.4 实验溶液

4.2.5 质粒的构建

4.2.6 酵母电转感受态细胞制备

4.2.7 酵母电转化

4.2.8 荧光定位

4.2.9 酵母点板实验

4.2.10 酵母蛋白提取和Western blot

4.2.11 TCA沉淀培养基中的蛋白

4.3 结果与讨论

4.3.1 在O.minuta中对PER1,GUP1和CWH43 同源基因的鉴定

4.3.2 O.minuta PER1,GUP1和CWH43 在酿酒酵母中的功能验证

4.3.3 O.minuta per1,gup1和cwh43 敲除型菌株的表型分析

4.3.4 GPI锚定蛋白在O.minuta突变细胞中的定位

4.3.5 Gas1 蛋白在O.minuta突变细胞中的分布

4.4 本章小结

主要结论与展望

主要结论

展望

论文主要创新点

致谢

参考文献

附录:作者在攻读博士学位期间发表的文章

文章来源

类型: 博士论文

作者: 胥欣欣

导师: 高晓冬

关键词: 糖基化,拓扑结构,重塑

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 江南大学

分类号: Q75

DOI: 10.27169/d.cnki.gwqgu.2019.000043

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内质网N-糖基化相关蛋白的拓扑学和GPI重塑相关基因的研究

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