乳杆菌胞外多糖抗氧化活性研究

论文摘要

生物体在正常的新陈代谢中会不断产生自由基,而自由基释放过量便会导致自由基的积累,从而使自身的抗氧化体系不能够完全抵御自由基对机体的损伤。乳酸菌胞外多糖（EPS）是一种具有生物活性的大分子物质。研究证明乳酸菌胞外多糖具有明显的抗氧化活性。本实验主要通过从8株产胞外多糖的乳杆菌中筛选出一株产高抗氧化活性多糖的菌株,对其抗氧化性进行评价并初步分析其结构。首先从Lactobacillus casei Y3,L.casei Y4,L.casei Y16,Lactobacillus planterum Y41,L.planterum Y42,L.planterum Y44,L.casei Y35,Lactobacillus rhamnosus GG这8株菌株的MRS培养液中采用醇沉-水提法提取EPS,通过测定EPS的DPPH自由基清除率、ABTS·+清除率、羟自由基清除率、铁离子还原力（FRAP）、氧自由基吸收能力（ORAC）及对ABAP氧化损伤HT-29细胞的保护作用评价8株菌所产EPS抗氧化性,通过主成分分析法得出Y42菌株EPS抗氧化活性的综合得分最高即Y42菌株产生的胞外多糖的抗氧化性最强,因此选取Y42菌株所产EPS进行后续实验。将浓度为500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL的Y42菌株的EPS作用于ABAP氧化损伤的HT-29细胞,结果显示随着胞外多糖浓度的降低,氧化损伤HT-29细胞的存活率逐渐降低,但都显著高于氧化损伤组（p<0.05）;并发现Y42菌株EPS显著上调HT-29细胞过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的表达量（p<0.05）;多糖预处理后细胞内谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性也显著高于氧化组（p<0.05）。最后采用DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱对Y42粗多糖进行分离纯化,得到了两个组分,分别为42-1中性多糖以及42-2酸性多糖。采用高效液相色谱测定Y42粗多糖的单糖组成为甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖,其摩尔比为11.30:3.51:10.64:7.53:7.19。对Y42粗多糖进行红外光谱扫描,结果表明该糖具有典型的特征吸收峰,属于吡喃糖环的骨架模式。根据实验结果推测,L.planterum Y42胞外多糖可能是通过清除氧自由基、以及促进HT-29细胞抗氧化酶系的表达起到保护HT-29细胞免受ABAP自由基损伤。

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第一章绪论

1.1 自由基与生物体抗氧化的关系

1.1.1 自由基的含义

1.1.2 自由基与氧化应激

1.1.3 抗氧化系统

1.2 乳酸菌胞外多糖的研究进展

1.2.1 产胞外多糖的乳酸菌

1.2.2 胞外多糖的分类

1.2.3 乳酸菌胞外多糖的生理功能

1.3 乳酸菌胞外多糖抗氧化活性

1.3.1 乳酸菌胞外多糖抗氧化活性的体外实验

1.3.2 乳酸菌胞外多糖抗氧化活性的体内实验

1.4 乳杆菌胞外多糖结构的研究

1.5 研究背景及目的意义

1.6 研究内容

第二章材料与方法

2.1 材料与设备

2.1.1 试剂与药品

2.1.2 仪器与设备

2.1.3 实验菌株和细胞

2.2 实验方法

2.2.1 多糖的提取

2.2.2 乳杆菌胞外多糖含量的测定

2.2.3 胞外多糖中蛋白含量的测定

2.2.4 胞外多糖体外抗氧化能力测定方法

2.2.5 HT-29 细胞内活性抗氧化酶的表达及活性测定

2.2.6 Y42 胞外多糖的分离纯化及结构解析

2.2.7 统计分析

第三章结果与讨论

3.1 8株菌株胞外多糖含量及蛋白浓度

3.2 体外抗氧化能力评价结果

3.2.1 DPPH·清除能力测定结果

3.2.2 ABTS·+清除能力测定结果

3.2.3 羟自由基清除能力的测定结果

3.2.4 铁离子还原力（FRAP）结果

3.2.5 ORAC抗氧试验结果

3.2.6 ABAP半致死浓度确定

3.2.7 EPS对 ABAP氧化损伤HT-29 细胞的保护作用

3.3 不同抗氧化方法相关性分析

3.4 产高抗氧化性多糖的筛选

3.5 HT-29 细胞内活性抗氧化酶的表达及活性测定

3.5.1 不同浓度Y42 菌株EPS对氧化损伤HT-29 细胞的保护作用

3.5.2 HT-29 细胞过氧化氢酶（CAT）表达量

3.5.3 HT-29 细胞超氧化物歧化酶（SOD）表达量

3.5.4 HT-29 细胞GSH-Px酶活

3.6 Y42 胞外多糖的分离纯化及结构解析

3.6.1 Y42 胞外多糖DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱纯化

3.6.2 单糖组成分析

3.6.3 红外光谱分析

第四章结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

参考文献

致谢

附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张雨晴

导师: 牟光庆,妥彦峰

关键词: 乳杆菌,胞外多糖,抗氧化活性,结构

来源: 大连工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 大连工业大学

分类号: TS201.3

DOI: 10.26992/d.cnki.gdlqc.2019.000041

总页数: 65

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