程能
中南民族大学生命科学学院湖北武汉430074
【摘要】目的：观察乙酰胆碱抑制剂多奈哌齐对Kv4.2通道的抑制作用。方法：将大鼠的Kv4.2通道转染于HEK293细胞中，在灌流系统中给予80μM多奈哌齐，运用全细胞膜片钳技术记录给药前后电流的变化。结果：80μM的多奈哌齐可以明显的抑制Kv4.2通道的电流。结论：在神经元系统中多奈哌齐除了可以乙酰胆碱酯酶之外，可能还可以抑制Kv4.2钾离子通道。
【关键词】多奈哌齐，Kv4.2通道，HEK293细胞
Abstract：objective：ToobservetheinhibitoryeffectoftheacetylcholineinhibitordonepezilonKv4.2channel.Methods：theKv4.2channelofratswastransfectedintoHEK293cells，andintheperfusionsystem，donepezilof80Mwasgiven，andthechangesofcurrentwererecordedbythewholecellpatchclamptechnique.Results：thecurrentofKv4.2channelcanbesignificantlyinhibitedby80Mdonepezil.Conclusion：donepezilnotonlysuppresstheacetylcholinesterase，butasloinhibitsKv4.2potassiumchannels.
Keywords：donepezil；Kv4.2channel；HEK293cell；
目前治疗阿尔茨海默症（AD）的一线药物是乙酰胆碱酶抑制剂，多奈派齐（Donepezil）是美国FDA批准的第2个AchEI，目前在全世界应用最广泛。特异性可逆抑制脑内AchE，对认知障碍有明显改善。其疗效好、安全性高、使用剂量小、服用方便，不良反应少，没有任何肝脏毒性，不需监测肝功能，是他克林的安全替代药[1]。
神经元细胞中广泛表达钾离子通道，其中就包括Kv4.2通道，Kv4.2和Kv4.3通道组成瞬时外向钾电流重要功能结构，在细胞的早期复极化中扮演着重要角色，这两种通道在神经系统中广泛表达[2]。它们参与了神经元的损伤和细胞死亡，Kv4.2通道的mRAN高表达于神经毒素损伤的细胞中，本研究主要初步探讨多奈哌齐对转染于HEK293中Kv4.2通道的影响。
1.材料与方法
1.1实验材料与试剂
DMEM培养基（美国Hyclone公司）；HEK293细胞；胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；Lipofectamine2000（美国invitrogen公司）；PCR引物（擎科生物）；DNAmaker（武汉三心达）；核酸染料（东盛）；细胞培养瓶（美国Corning公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；24孔细胞培养板（武汉三心达公司）；培养皿（美国Corning公司）；OPTI-MEM（美国Hyclone公司）；卡维地洛（美国Sigma公司）。
1.2实验方法
（1）细胞的培养：复苏细胞，将-80°C超低温冰箱内冻存HEK-293细胞取出，37°C的恒温水浴锅中下快速融化，该过程不超过3分钟。融化后的细胞在低速离心机中进行离心，转速为800rpm/分，时间3分钟。离心后的细胞在无菌操作台中用移液枪吸去上清液，吸取500μl的培养基于冻存管中，轻轻吹打细胞沉淀，然后将细胞悬液移入到事先准备好的培养瓶中，补充2-3ml的培养基，将培养瓶置于37℃的二氧化碳培养箱进行培养。
（2）细胞的处理：将培养的细胞置于显微镜下进行观察，选取密度比较高（约为75%HEK293细胞），贴壁好的细胞，在无菌操作台中先倒掉培养瓶中的培养基，吸取1ml的PBS溶液于培养瓶中清洗一下，倒掉PBS，加入0.5ml的胰酶消化20秒，然后倒掉胰酶，加入2ml的培养基用移液枪进行吹打，吸取细胞悬浮液于24孔板中，每个孔中滴入4-6滴细胞悬浮液，最后将24孔板置于细胞培养中进行培养，为后续质粒的转染做准备。
（3）膜片钳实验：打开开关使给药系统中的细胞外液沿着塑料管流入到灌流槽中，然后从培养箱中取出24孔板中的细胞放置于灌流槽中，打开Clampex软件，调节好软件的各种实验参数，然后打开Clamfit软件，该软件用来实验数据的分析。随后，使用电极拉制仪拉制玻璃微电极管，一般我们选取电极电阻在2-4MΩ来进行全细胞的封接实验。
（4）数据分析：原始实验数据由Clampex软件记录，通过Clamfit和Origin7.5软件对数据进行分析和绘图。
2.实验结果
2.1多奈哌齐抑制了Kv4.2通道的电流
我们测试了多奈哌齐对Kv4.2通道的全细胞电流会有怎样的影响。实验刺激方案为：在-80mV的钳制电压下，增幅为10mV，直至+60mV，持续时间为300ms。从图中可以看出，80μM多奈哌齐能显著抑制Kv4.2通道电流。
2.2多奈哌齐对Kv4.2通道的I-V曲线图
将原始数据（n=）进行统计分析后绘制的电流-电压曲线（I–V曲线），在+60mV处，对照电流为5.5±0.3nA，在80μM多奈哌齐作用下，该通道电流减小为2.8±0.3nA。由此可以得出多奈哌齐可以明显的抑制Kv4.2通道的电流。
3.讨论
阿尔茨海默症是一种不可逆的中枢神经系统的退行性疾病。主要临床表现为进行性学习、记忆和认知能力的减退；主要病理特征为新皮层、海马出现高密度老年斑（SP），神经纤维缠结（NFTs）和大量神经元的丢失等。β淀粉样蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）是构成老年斑的重要成分[3]。有资料表明，Aβ可抑制多种K+通道功能，使细胞膜复极过程延缓、动作电位时间延长，细胞兴奋性改变、放电频率增加等[4]。
乙酰胆碱酯酶（AchE）活性反映了胆碱能神经元的活性，胆碱能调节大脑皮层和海马中神经生长因子（NFG）的合成与释放[5]。Aβ沉积会增加AchE表达，造成Ach神经递质的异常，并进一步导致Aβ的沉积和NFT形成，产生恶性循环的Aβ毒害作用。目前用于治疗AD的一线药物胆碱酯酶抑制剂可阻滞突触中ACh的水解，提高大脑中Ach的水平，恢复胆碱能神经传导，从而改善病人症状[6]。有研究报道，AChE抑制剂能够影响中枢神经元钾通道，来协同其AChE抑制剂的作用。Donepezil是乙酰胆碱抑制剂，用于治疗阿尔茨海默症。有研究表明Donepezil可抑制多种钾离子通道电流，如hERG通道、Kv2.1、内向整流钾通道等[7]。
Kv4.2在神经细胞中高表达，本实验初步探究了多奈哌齐对于Kv4.2通道电流的抑制作用，为该药物新的潜在作用靶点提供了依据，但其确切的作用机制需进一步研究。
参考文献：
[1]曾秘，顾克敏，蒋英兰.阿尔茨海默病及治疗药物研究概况[J].中国药业，2006，15（6）：59-60.
[2]王勋，殷昊，周晋，张黎明.侧脑室注射中药提取物三氧化二砷对海马神经元Kv4.2和Kv4.3钾通道表达的影响[J].中医药学报，2013，41（05）：66-69.
[3]ChaeYJ，LeeHJ，JeonJH，KimIB，ChoiJS，SungKW，HahnSJ.EffectsofdonepezilonhERGpotassiumchannels.BrainRes.2015Feb9；1597：77-85.doi：10.1016/j.brainres.2014.11.057.PubMedPMID：25498859.
[4]张宇.一、β淀粉样蛋白31-35片段对海马CA1神经元BK通道和[Ca2+]_i的影响：全细胞膜片钳和离子荧光成像技术观察二、Humanin对Aβ31-35抑制大鼠海马神经元BK电流及升高[Ca2+]_i作用的观察三、I型代谢型谷氨酸受体参与脊髓痛信号传递作用的观察[D].山西医科大学，2007.
[5]ChaeYJ，LeeHJ，JeonJH，KimIB，ChoiJS，SungKW，HahnSJ.EffectsofdonepezilonhERGpotassiumchannels.BrainRes.2015Feb9；1597：77-85.doi：10.1016/j.brainres.2014.11.057.PubMedPMID：25498859.
[6]YuanH，WangWP，FengN，WangL，WangXL.Donepezilattenuatedoxygen-glucosedeprivationinsultbyblockingKv2.1potassiumchannels.EurJPharmacol.2011Apr25；657（1-3）：76-83.doi：10.1016/j.ejphar.2011.01.054.PubMedPMID：21300054.
[7]ZhongCB，ZhangW，WangXL.[Effectsofdonepezilonthedelayedrectifier-likepotassiumcurrentinpyramidalneuronsofrathippocampusandneocortex].YaoXueXueBao.2002Jun；37（6）：415-8.Chinese.PubMedPMID：12579795.
作者简介：程能（1991.08-），男，湖北省鄂州人，武汉市洪山区中南民族大学，发育生物学，硕士研究生