基于CRISPR/Cas9类植物乳杆菌基因编辑载体构建及电转化条件研究

论文摘要

类植物乳杆菌（Lactobacillus paraplantarum）,是一种具有多种益生特性的乳酸菌。随着基因编辑技术的发展,人们对类植物乳杆菌不再是仅局限于基本的生理性能的探究,对其遗传操作的研究是目前研究的热点内容。目前已有研究表明CRISPR/Cas技术可用于乳酸菌的基因编辑。由于类植物乳杆菌复杂且致密的细胞壁结构,使得外源质粒的转入变得困难,限制其遗传操作的研究。因此本研究将从构建CRISPR/Cas基因编辑载体和探究转化条件两方面着手。本研究以质粒pLCNICK、pLP-gba为基础,从质粒pLCNICK上扩增出Cas9启动子片段和红霉素抗性基因终止子片段,与从质粒pLP-gba扩增的LP404142融合基因CDS区片段,通过Easy Geno快速重组克隆方法克隆到线性pUC19载体上,命名为质粒A。然后从质粒pLCNICK上扩增出包含卡那霉素抗性基因-gRNA基因的长片段,和包含启动子与终止子的红霉素抗性基因片段,克隆到线性pUC19载体上,命名为质粒B。最后把质粒A上启动子-LP404142-终止子片段与质粒B上卡那霉素-gRNA-红霉素基因片段和质粒pLCNICK的Cas9基因片段融合成一个质粒,命名为质粒C。质粒C经双酶切和测序检验正确,可以进行类植物乳杆菌的基因编辑研究。本研究用质粒pMG36e,来探究类植物乳杆菌的电转化条件。影响转化效率的各种单因素实验和正交实验结果显示:制备感受态细胞合适条件是类植物乳杆菌在含2%甘氨酸的MRS培养基（并含0.3 mol/L蔗糖）中培养6 h,合适的电转化条件是质粒添加量15μg,在电压1.6 kV、电容25μF和电阻400Ω程序下电击,电击完成后复苏培养2h,转化效率可以达到145.50（CFU/μg DNA）。我们构建的质粒C,将为类植物乳杆菌基因功能研究提供方便,另外我们的转化方法也可以为其它革兰氏阳性菌的转化提供借鉴。

论文目录

摘要

Abstract

1 引言

1.1 乳酸菌概述

1.2 基因编辑技术概述

1.3 CRISPR/Cas系统概述

1.3.1 CRISPR/Cas系统组成及分类

1.3.2 CRISPR/Cas系统作用机制及应用

1.3.3 CRISPR/Cas9 系统在乳酸菌中的应用

1.4 乳酸菌的转化方法

1.5 研究目的及意义

1.6 技术路线

2 载体构建

2.1 试验材料

2.1.1 菌种及质粒

2.1.2 试剂及仪器设备

2.1.3 培养基及溶液

2.1.4 引物

2.2 试验方法

2.2.1 质粒pLCNICK的提取

2.2.2 质粒pLP-gba的提取

2.2.3 质粒A的构建

2.2.4 质粒B的构建

2.2.5 质粒C的构建

2.3 结果与分析

2.3.1 pLCNICK质粒

2.3.2 质粒A的构建结果

2.3.3 质粒B的构建结果

2.3.4 质粒C的构建结果

2.4 讨论

2.5 小结

3 类植物乳杆菌电转化条件的优化

3.1 实验材料

3.1.1 菌种及质粒

3.1.2 试剂及仪器设备

3.1.3 培养基及溶液

3.1.4 引物

3.2 方法

3.2.1 生长曲线的测定

3.2.2 大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pMG36e的制备

3.2.3 感受态细胞的制备

3.2.4 电转化

3.2.5 转化子的筛选及验证

3.2.6 转化效率的计算

3.2.7 电转化条件的优化

3.3 结果与分析

3.3.1 生长曲线的测定

3.3.2 大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pMG36e

3.3.3 电转化条件的优化

3.3.4 转化子的验证

3.4 讨论

3.5 小结

4 结论与展望

4.1 结论

4.1.1 载体构建

4.1.2 类植物乳杆菌电转化条件的优化

4.2 展望

参考文献

附录

后记

攻读学位期间取得的科研成果清单

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 于楠楠

导师: 闫洪波

关键词: 类植物乳杆菌,质粒,电转化

来源: 河北经贸大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 河北经贸大学

分类号: Q78

总页数: 58

文件大小: 1927K

下载量: 244

基于CRISPR/Cas9类植物乳杆菌基因编辑载体构建及电转化条件研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢