利用GmNH23基因过表达转基因植物对其广谱抗病毒特性的研究

论文摘要

植物中克隆得到的抗病（resistance,R）基因大多数编码NBS-LRR类蛋白。本实验室在前期研究中从大豆中克隆得到了一个NBS-LRR家族抗病毒蛋白编码基因GmNH23,对TMV（tobacco mosaic virus,烟草花叶病毒）和 SMV（soybean mosaic virus,大豆花叶病毒）具有抗性。前期研究中我们只做了GmNH23基因的瞬时表达及抗性研究,而未进行稳定表达及其功能验证。为了验证GmNH23稳定表达后的抗性,并验证其是否具有广谱抗病毒活性,本论文以马铃薯敏感品种夏波蒂为材料,得到了过表达GmNH23转基因马铃薯,对其抗病毒活性进行了研究。建立了高效的马铃薯再生及遗传转化体系。转化体系如下:马铃薯叶片预培养、共培养培养基为MS+1.6%葡萄糖+5 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA;愈伤组织芽诱导培养基为MS+1.6%葡萄糖+0.02 mg/L NAA+0.02 mg/L GA3+2.0 mg/L ZTR;农杆菌菌液侵染浓度OD600=0.7,侵染时间为15 min,共培养2 d;特美汀和头孢曲松钠作为脱菌剂,浓度分别为200 mg/L和500 mg/L;由于遗传转化所用的两种重组载体骨架上分别具有潮霉素（Hyg）和卡那霉素（Kan）标记基因,故采用两者进行抗性筛选,在芽诱导及生根阶段的浓度分别为4 mg/L和50 mg/L。经愈伤组织再分化与抗生素筛选后获得多株马铃薯转化幼苗,经基因组PCR技术鉴定到了21个阳性植株,经RT-PCR进一步检测发现16株转基因株系成功表达了GmNH23基因,Western blot实验也证明了GmNH23蛋白的表达。PVY（potato virus Y,马铃薯Y病毒）是一种马铃薯的严重病害,且与SMV同属马铃薯Y病毒科（Potyviridae）。利用PVY对GmNH23过表达马铃薯幼苗进行侵染发现与野生型植株相比,转基因植株的症状明显减轻;同时对前期实验室获得的过表达本氏烟草幼苗进行PVX、PVY侵染发现与野生型植株相比,转基因植株的症状明显减轻,在野生型本氏烟草中瞬时表达GmNH23后侵染两种病毒,也均出现超敏反应,说明GmNH23对PVX、PVY均具有抗性。本研究同时获得了GmNH23基因过表达的转基因烟草,对其T3代经基因组PCR检测发现阳性检出率为100%,经RT-PCR进一步检测,阳性检出率为80%。利用TMV-GFP对GmNH23基因过表达的转基因烟草进行侵染,发现与野生型植株相比,转基因烟草的病毒扩散率降低了约5倍,说明GmNH23在烟草中的稳定表达也表现对TMV的抗性。综上所述,本论文的结果表明从大豆中克隆得到的GmNH23基因不仅对SMV具有抗性,同时还对PVX、PVY和TMV具有抗性,说明其具有广谱抗病毒特征。本论文的研究成果为利用GmNH23改良作物对病毒的抗性打下了理论基础。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李姗姗

导师: 哈达

关键词: 抗病基因,转基因马铃薯,转基因烟草,病毒病害

来源: 内蒙古大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,植物保护

单位: 内蒙古大学

基金: 内蒙古自治区科技计划项目(项目编号:21400-5183304),国家自然科学基金(项目编号:31570142),内蒙古自然科学基金项目(项目编号:21400-5173130)

分类号: Q943.2;S435.32

总页数: 62

文件大小: 2196K

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