导读:本文包含了果胶甲基酯酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:果胶,甲基,内酯,辣椒,油菜,拟南芥,香蕉。
果胶甲基酯酶论文文献综述
周杨骄,李瑞梅,袁帅,仇婷婷,姚远[1]（2019）在《木薯果胶甲基酯酶抑制因子MePMEI1的生物信息学分析》一文中研究指出为探讨木薯MePMEI1的分子结构特征。通过PCR扩增和测序技术及生物信息学分析工具对木薯MePMEI1基因进行克隆、测序及相关生物信息学分析。结果表明木薯MePMEI1基因编码区全长609 bp,编码202个氨基酸残基;MePMEI1基因编码蛋白分子量21.78 k D,理论等电点(pI)约为5.51;生物信息学预测发现,木薯MePMEI1蛋白是稳定的亲水蛋白;具有跨膜区为分泌蛋白;含有1个PMEI结构域,1个糖基化位点,31个磷酸化位点;二、叁级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。该蛋白的生物功能可能与细胞被膜、酶和生长因子等相关。木薯MePMEI1基因的生物信息学分析为进一步研究其遗传特性和生理生化机制提供了理论依据。(本文来源于《基因组学与应用生物学》期刊2019年03期）
张清凤[2]（2017）在《果胶甲基酯酶在油菜素内酯调节拟南芥生长发育中的作用》一文中研究指出果胶是植物细胞壁的主要成分之一,其结构和功能与酯化程度密切相关。PME使果胶去甲酯化形成果胶酸和甲醇,果胶甲基酯酶抑制蛋白(PMEI)抑制PME活性。研究发现BR信号能够调节细胞壁果胶甲酯化状态,而果胶甲酯化状态亦能反馈调节BR信号传递。虽然已有大量研究表明BR在植物生长发育中具有重要作用,然而细胞壁果胶及其甲酯化变化在BR作用下对生长发育的影响及其机理尚不明确。本论文以拟南芥为材料,通过分子生物学与遗传学的方法,研究了PME41和PMEI7在BR调节植物生长和发育中的作用及其相互关系。本论文主要得到以下研究结果:1.构建了35S::PME41植物表达载体,并将其转入拟南芥Col-0野生型获得了PME41基因过表达(oxPME41)转基因植株,通过人工杂交的方法,获得了BR合成突变体det2与oxPME41的杂交植株oxPME41/det2以及det2与pme41突变体的杂交植株pme41/det2,分析了不同基因型植物中的PME活性。结果显示,与非转基因植株相比,oxPME41和oxPME41/det2的PME活性升高,表明PME41在植物中具有果胶甲基酯酶活性。然而,与野生型相比,pme41突变、det2突变体以及pme41/det2中的PME活性均没有显着变化,表明PME41对组织整体的PME活性没有显着贡献。2.构建了PME41-pro::GUS的植物表达载体,并将其转入拟南芥Col-0野生型获得了PME41-pro::GUS转基因植株,分析了PME41的组织表达特异性。结果显示,12天幼苗中,GUS在子叶、真叶、根的成熟去和伸长区中表达量较高,而在下胚轴、叶柄、根尖的根冠和分生区中表达量极低。萼片、花柱中均能检测到GUS的表达,而在花瓣、花药以及柱头上几乎没有表达。随着花发育时期的变化,第13、14期花丝里的表达增强。这些结果表明PME41在植物的不同组织中表达量有较大差异,可能在花丝发育中具有重要的作用。3.构建了35S::PMEI7植物表达载体,并将其转入拟南芥Col-0野生型获得了PMEI7基因过表达(oxPMEI7)转基因植株,通过人工杂交的方法,获得了BR合成突变体det2与oxPMEI7的杂交植株oxPMEI7/det2,分析了转基因对PME活性的影响。结果显示,oxPMEI7中的PME活性降低,oxPMEI7/det2中的PME活性变化不大。结果说明PMEI7具有果胶甲基酯酶抑制蛋白活性,但其抑制作用可能与BR相关。4.分析了PME41、PMEI7和BR合成突变对拟南芥根的生长的影响。结果发现,与Col-0野生型相比,det2显着抑制根的生长,具有极短的根,而pme41突变体、PME41或PMEI7过表达植株的根长均与野生型相近。有意思的是,pme41/det2、oxPME41/det2和oxPMEI7/det2的根长均显着大于det2,部分修复了det2突变体的生长缺陷表型。对PME41/PMEI7修复det2根生长的机理进行了初步分析,发现pme41/det2、oxPME41/det2和oxPMEI7/det2的根尖伸长区细胞明显地比det2长,进而影响根的伸长,这可能是引起它们根长变化的主要原因之一。5.分析了PME41、PMEI7和BR合成突变对拟南芥不同发育时期的影响。结果发现,与det2相比,pme41/det2、oxPME41/det2和oxPMEI7/det2表现出莲座叶变大,花序分枝数增加,果荚变小,种子体积增大,数量减少等表型。对PME41/PMEI7降低det2育性的机理进行了初步探讨,发现pme41、oxPME41或oxPMEI7不影响det2的花粉粒活性和花粉管长度,而花丝长度的统计发现pme41/det2、oxPME41/det2和oxPMEI7/det2的花丝较短,这可能是引起拟南芥长角果大小变化的主要原因。6.qPCR的分析结果表明,BR合成相关基因DET2,CPD和DWF4的表达在pme41,oxPME41以及oxPMEI7植株中有不同程度的下调作用;反过来,在BR的不同突变体det2,dwf4和bri1-116中,一些PME和PMEI基因有不同程度的上调作用,可见果胶甲酯化修饰基因的变化与BR合成基因之间存在密切的关系。此外,相比于在det2中的表达,生长相关基因PRE1及SAUR-AC1在pme41/det2、oxPME41/det2和oxPMEI7/det2中的表达均有不同程度的下调,并且保持相对稳定的状态。以上结果表明内源BR水平的变化与PME和PMEI之间存在复杂的关系。本论文通过分析PME41和PMEI7基因在拟南芥中的作用,研究了细胞壁果胶甲酯化变化对生长发育的影响。结果表明,在内源BR水平正常情况下(Col-0野生型),细胞壁果胶甲酯化变化对生长发育影响不大;但在内源BR水平较低时(det2,BR合成突变),细胞壁果胶甲酯化的改变(甲酯化或去甲酯化)能激活BR信号传递途径,部分恢复BR水平降低导致的生长缺陷,并产生一些特殊的生物学功能。(本文来源于《兰州大学》期刊2017-05-01）
周林燕,廖小军,曹霞敏,刘凤霞,毕秀芳[3]（2014）在《高压二氧化碳对桃果胶甲基酯酶活性的钝化效果与动力学研究》一文中研究指出采用高压二氧化碳技术(High Pressure Carbon Dioxide,HPCD)处理桃果胶甲基酯酶(Pectin Methylesterase,PME)粗酶液,分析了HPCD对粗酶液中PME的钝化效果及动力学,进一步比较了粗酶液和桃汁两种体系中PME对HPCD的敏感性。HPCD对粗酶液中PME具有较好的钝化效果,处理温度和压力的共同作用导致了PME活性降低,钝化动力学遵从一级动力学模型。随着处理压力和温度的提高,钝化速率逐渐增大,而指数递减时间则逐渐减小;在最优的处理条件(22MPa、55℃)下,HPCD钝酶的钝化速率和指数递减时间分别为0.408 8min-1和5.63min。温度为55℃时HPCD钝酶的压力敏感指数为16.40MPa,活化体积为-383.00cm3/mol;压强为15MPa时HPCD钝酶的温度敏感指数为13.30℃,活化能为1 845.86kJ/mol。比较HPCD对桃汁和粗酶液中PME的钝化效果,发现HPCD处理16min后(15MPa、55℃),桃汁中PME残存酶活在80%左右,而粗酶液中PME活性已完全钝化,表明桃汁体系中存在保护PME活性的因素,有关机制需要进一步研究。(本文来源于《高压物理学报》期刊2014年06期）
陈鹏[4]（2013）在《真菌果胶甲基酯酶的重组制备及性质表征》一文中研究指出果胶是一类富含多聚半乳糖醛酸的天然高分子化合物,是植物细胞壁的重要组成部分。果胶甲基酯酶能催化果胶的半乳糖醛酸链上的甲氧基去甲氧基化,因此具有降解果胶的活性。黑曲霉来源的果胶甲基酯酶在果汁生产中可以有效控制果汁的澄清和浑浊,但黑曲霉能产生多种果胶酶,这些酶的生化性质相似,为果胶甲基酯酶的纯化带来困难,重组制备黑曲霉果胶甲基酯酶是一种可行、有效的方法。另一方面,黄曲霉分泌的果胶甲基酯酶是黄曲霉侵染植物时的致病因子之一,抑制该酶活性可控制黄曲霉对作物的侵染。另外,真菌来源的果胶甲基酯酶的催化机制与细菌及植物来源的不同,有必要研究真菌果胶甲基酯酶的结构和功能,但真菌果胶甲基酯酶的晶体结构还未见报道。因此,本论文以黑曲霉果胶甲基酯酶和黄曲霉果胶甲基酯酶为研究对象,分别对这2个酶进行了重组制备及性质表征。(1)黑曲霉果胶甲基酯酶的克隆表达、分离纯化及性质表征克隆了黑曲霉果胶甲基酯酶基因,利用组成型表达载体pGAPZα在毕赤酵母中成功地分泌表达了该酶,而且无需甲醇诱导,避免了工业上甲醇诱导的不便。利用HiTrapTM QXL阴离子交换柱层析和ResourceS阳离子柱层析分离纯化得到电泳纯蛋白,其中比活力为342U/mg,蛋白纯化活力回收率为28%。对纯化后的重组酶进行了性质分析,得到Vmax为1.376mmol/(min×mg), Km为0.19%pectin(w/v)≈8.6mmol/L, Kcat为8.26x103S-1,最适温度为50℃,最适pH为4.7,且该酶在30-50℃、pH4.0-6.0稳定性较好。该酶能够被K+、Mg2+、C02+、Mn2+、Ni2+离子抑制活性,Na+对酶活力没有影响。(2)黄曲霉果胶甲基酯酶的重组表达、分离纯化及其抑制剂筛选利用载体pPIC9在毕赤酵母GS115中表达了黄曲霉果胶甲基酯酶基因。通过亲和色谱层析和离子交换两步纯化,得到了电泳纯的重组黄曲霉果胶甲基酯。对该酶进行了性质分析,其最适pH为4.8,最适温度为55℃,同时发现该酶对中等甲酯化度果胶表现出更强催化活性。通过抑制剂筛选,发现带有五倍子酸基团的植物多酚(EGCG)和绿茶提取物多酚(PP60)对该酶有抑制活性。(3)黑曲霉果胶甲基酯酶的原核表达及结晶条件研究黑曲霉果胶甲基酯酶和黄曲霉果胶甲基酯酶在毕赤酵母细胞中的表达,都存在不均一性的糖基化现象,糖基化不均一的蛋白质很难形成结晶,所以采用在大肠杆菌原核系统里表达这2个酶。研究发现黄曲霉果胶甲基酯酶在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,而黑曲霉果胶甲基酯酶在大肠杆菌系统里得到了可溶性表达。通过一步亲和层析进行了黑曲霉果胶甲基酯酶的分离纯化,其纯度达到95%以上。利用Hampton公司的结晶试剂盒,初步筛选出3个适合该酶晶体生长的条件,并生长出微晶体。(本文来源于《大连理工大学》期刊2013-05-03）
董章勇,王振中[5]（2012）在《香蕉枯萎病菌果胶甲基酯酶基因的克隆与生物信息学分析》一文中研究指出旨在了解香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)4号生理小种(FOC4)PME基因序列特征,根据同源物种PME相关序列设计引物,利用PCR和RT-PCR技术,克隆FOC4序列基因和开放阅读框,命名为Foc4Pme。结果表明,所获得的PME基因均含有2个内含子和3个外显子,990 bp的片段,编码329个氨基酸。预测编码蛋白有信号肽,具有1个功能位点,其分子质量和等电点分为34.894 8 kD和9.17,该蛋白为稳定存在的蛋白。该蛋白疏水性最大值为2.022,最小值为-2.156,大部分区域为亲水区。该基因编码的蛋白具有一定保守性,进化上与镰刀菌亲缘关系最近。(本文来源于《生物技术通报》期刊2012年06期）
潘伟槐,郑仲仲,郭天荣,王超,寿建昕[6]（2011）在《果胶甲基酯酶PME参与调控大麦根尖铝毒敏感性》一文中研究指出利用大麦耐铝品种和敏感品种来分析根尖果胶甲基酯酶(PME)在大麦铝毒敏感性中的调控作用.通过对耐铝性差异极其显着的2个大麦明品种2000-2与沪麦16经铝处理后的Morin荧光检测,观察到2000-2根尖荧光明显比沪麦16强,铝试剂比色法测定结果进一步表明,敏感品种根尖细胞壁上铝积累量比耐铝品种高,达到极显着差异(p<0.05或0.01).对根尖PME活性分析结果表明,与对照相比,铝处理4 h的2000-2根尖PME活性显着上升,但处理24 h后PME活性又显着下降;而沪麦16的PME活性与对照相比无显着性差异.这些结果表明细胞壁上铝积累与PME活性变化有密切的相关性,证实PME活性参与调控大麦铝毒敏感性.(本文来源于《浙江大学学报(理学版)》期刊2011年03期）
贾永健,冯宝珍,李培谦,张修国,付红波[7]（2009）在《辣椒疫霉(Phytophthora capsici)果胶甲基酯酶Pcpme3基因真核表达及功能研究》一文中研究指出【目的】对辣椒疫霉果胶甲基酯酶Pcpme3基因进行真核表达,制备其特异性抗血清,为用Westernblot检测该基因在辣椒疫霉致病过程中的功能奠定基础。【方法】利用TR-PCR分离鉴定Pcpme3的成熟肽片段,克隆于pPIC9K载体。将获得的表达载体转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析和免疫家兔制备特异性抗体。【结果】酵母转化子经MD、MM平板筛选和G418抗生素筛选与PCR鉴定,获得Mut+/His+表型高拷贝重组转化子,经1%甲醇诱导后,SDS-PAGE检测发酵上清液,检测出43kD的特异蛋白。重组蛋白免疫家兔制备特异抗血清,Westernblot检测该基因在游动孢子侵染辣椒叶片中的表达,随着病情加重,该基因的表达逐渐增强,从而证明该基因参与了病菌的侵染致病过程。【结论】利用真核表达获得的蛋白制成特异性抗体可以有效地检测Pcpme3在辣椒疫霉侵染寄主过程中的功能特性。(本文来源于《中国农业科学》期刊2009年06期）
陈徵尼[8]（2009）在《果胶甲基酯酶基因对油菜素内酯和一氧化氮的响应》一文中研究指出果胶甲基酯酶(pectin methylesterase,PME)是一种普遍存在于植物细胞中的果胶酶,主要起内源调控植物细胞壁上以及细胞之间果胶含量的作用。为了研究在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中油菜素内酯(Brassinolide BR)和一氧化氮(Nitric oxide NO)对PME基因的表达调控,我们进行了一系列实验,获得以下结论:1.BR和NO对PME基因的表达调控:研究表明,BR可以促进PME基因的表达,NO可以抑制PME基因的表达,并且NO能够抑制BR对PME基因的调控作用,但BR不能影响NO对PME基因的表达调控。这就说明,PME基因是BR和NO共同作用的位点,BR和NO可以共同调控该基因的表达,NO对PME基因的作用位点在BR对该基因作用位点的上游。由此可见,BR和NO的一些生理功能的调节可能是通过PME基因实现的。2.检测胁迫条件对拟南芥PME基因的影响:实验证明,盐胁迫,渗透胁迫,冷胁迫能够促进PME基因的表达,热胁迫能够抑制该基因的表达,并且这些胁迫对PME的调节是通过BR来完成的,BR能够响应盐胁迫、渗透胁迫、温度胁迫等植物的逆境胁迫,PME可能是BR响应这些胁迫的一个重要的作用位点。3.利用Gateway技术对拟南芥PME基因启动子和编码区的克隆以及植物表达载体的构建:根据已报道的拟南芥PME基因序列,通过PCR技术从拟南芥中扩增得到PME基因的启动子片段及CDS全长,利用Gateway克隆技术,将启动子构建到启动子分析载体pMDC163∶∶CUS上,获得植物表达载体pMDC-PME∶∶CUS,将CDS区构建到细胞定位分析载体pMDC43-GFP上,获得植物表达载体pMDC-PME-GFP,将其分别转入农杆菌GV3101中,通过花序浸染法转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株,为深入研究PME基因在拟南芥组织水平以及细胞水平上的定位奠定基础。(本文来源于《兰州大学》期刊2009-04-01）
贾永健[9]（2008）在《辣椒疫霉（Phytophthora capsici）5个果胶甲基酯酶基因克隆及pcpme1的功能研究》一文中研究指出辣椒疫病是一种世界性土传病害,严重影响我国及世界各国的辣椒生产,造成巨大的经济损失,该病由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)引起。辣椒疫霉菌是一种土传卵菌,以卵孢子或厚垣孢子在土壤及病残体中越冬,可以存活数月甚至更长时间,感病品种的重复种植能够导致卵孢子在土壤中大量积累。该菌可以在任何生长季节侵染寄主植物引起种苗死亡、茎腐、枯萎、果实腐烂;寄主范围广,可以侵染辣椒、西葫芦、黄瓜、茄子番茄等9科20多种作物。目前,对于辣椒疫病的防治主要采用轮作、化学防治和培育抗病品种。但是农药残留容易对环境造成污染;辣椒疫霉生理小种的变化造成抗病品种效果不稳定。因此,寻找探索辣椒疫霉菌重要的致病因素来控制病害已经成为科学家研究的热点。研究表明植物病原菌与寄主互作过程中分泌的果胶酶是重要的致病酶,这些酶包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶、果胶裂解酶,它们产生于病原菌识别、定殖及与寄主建立寄生关系的过程中,降解或软化细胞壁的果胶、中胶层乃至破坏寄主的防御体系,增强病原菌对寄主的亲合力。因此,植物病原菌在侵染寄主过程中所分泌的细胞壁降解酶是一类重要的致病因子,其活性高低是界定植物病原菌侵染与否或致病力强弱的重要技术指标之一。其中,果胶甲基酯酶(PME)是许多植物病原菌的致病因子,在植物发病过程中起重要作用。本研究以辣椒疫霉为研究对象,筛选多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶、果胶裂解酶活性较高的辣椒疫霉菌株,并构建了其基因组DNA文库,应用Pool PCR方法分离和克隆了5个pme基因。构建了pcpme1基因真核表达载体,通过诱导表达获得重组蛋白,用Anti-His抗体通过Western Blot检测了其表达情况,用Ni-NTA树脂纯化了表达的PCPME1,并制备了特异性抗体,用Western Blot检测了pcpme1在辣椒体内的表达情况;用PNGase F对PCPME1进行去糖基化处理,研究了糖基化位点对其活性的影响;找到pcpme1的活性中心位点,对其进行定点突变,然后进行真核表达,获得纯蛋白;应用RT-PCR和Northern Blot方法分析了其在辣椒体内的表达情况;用表达的原始PCPME1、去糖基化的蛋白,定点突变后的蛋白分别接种辣椒叶片,透射电镜观察其对寄主细胞壁的破坏作用。主要研究内容如下:采用分光光度法测定辣椒疫霉菌SDPH-33的多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶裂解酶的活性;滴定法测定了果胶甲基酯酶活性;结果发现,辣椒疫霉的致病性与其PGs、PELs、PMEs的活性密切相关。利用Pool PCR法筛选SDPH-33的基因组文库,从文库中共分离克隆了5个pme基因,并对其结构特征进行分析。对其序列和蛋白结构进行分析发现, 5个pme基因具有很高的同源性,所编码的蛋白具果胶甲基酯酶的保守序列和活性位点(GxYxE、QDTL、QAVAL、DFIFG和LGRPW),并具有不同数目的糖基化位点,其蛋白结构也具明显的相似性。根据比对不同来源的PME的氨基酸系列构建的进化树表明,辣椒疫霉的pme基因与卵菌的pme基因聚在一起,亲缘关系最近,明确了卵菌在自然界中的分类地位。用SDPH-33的游动孢子悬浮液接种4-6叶期辣椒叶片,提取发病叶片的总RNA,合成cDNA。根据pcpme的序列设计特异性引物,RT-PCR检测接种叶片内pcpme的表达情况。结果发现,接种后pcpme在发病辣椒体内均能表达,其表达量随着时间延长而加强,第7天表达量最高,而在健康辣椒组织中则没有发现任何pcpme的表达。结合RT-PCR的结果及基因的糖基化位点数目确定pcpme1为关键的致病基因,根据pcpme1的序列设计引物,PCR扩增片段以制备探针,Northern Blot结果表明,pcpme1基因在接种辣椒叶片内得到表达,结果于RT-PCR相似。根据已经克隆的pcpme1基因的序列,设计特异性引物,PCR扩增其成熟肽片断。重组至酵母分泌型表达载体pPIC9K,构建成重组表达载体pPIC9K-pcpme1,转化至大肠杆菌JM109中,筛选得到阳性克隆。重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115感受态细胞,经过G418筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到数株基因工程酵母菌。SDS-PAGE分析发现,目的蛋白分子量约为60KDa,比预期蛋白的分子量大,用anti-his抗体检测到pcpme1已经在毕赤酵母中获得了高效表达。通过Ni-NTA树胶纯化系统并透析后获得了表达的PCPME1融合蛋白,发现其对提取的辣椒细胞壁具有降解活性,通过将纯化的PCPME1蛋白免疫家兔,制备特异性抗体。Western Blot分析结果表明,pcpme1基因在发病的辣椒组织中获得了充分的表达,且随着发病程度的提高表达量逐渐增高。将纯化的PCPME1蛋白用PNGase F处理,获得了去糖基化的蛋白,分子量约为37Kda与预期蛋白的分子量相当,根据去糖基化前后蛋白的活性测定确定了糖基化对PMEs的活性不起决定性作用。根据前人报道的结果预测PCPME1的活性位点,并对其进行定点突变,将突变后的基因转化毕赤酵母,并诱导其表达,用Ni-NTA树胶纯化系统并通过透析获得了突变后的蛋白,突变前后蛋白的活性测定结果表明突变的氨基酸为该蛋白的活性位点。用纯化的野蛋白PCPME1、去糖基化的蛋白、突变后的蛋白分别接种4-6叶期的辣椒幼苗叶片,发现野蛋白和去糖基化的蛋白能够在叶片上引起病斑,且病斑的大小随接种时间的延长而增大;突变后的蛋白接种后则不能形成病斑;接种无菌水的对照叶片也没有表现症状。将接种后的辣椒用透射电镜观察其细胞壁的结构发现接种野蛋白和去糖基化的蛋白细胞壁被不同程度地降解,而接种突变蛋白和无菌水的辣椒其细胞壁基本保持完整。本实验的结果表明pcpme1是编码辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因家族中起致病作用的关键基因之一。(本文来源于《山东农业大学》期刊2008-05-01）
冯宝珍[10]（2008）在《辣椒疫霉菌4个果胶甲基酯酶基因的克隆和pcpme6的真核表达研究》一文中研究指出辣椒疫病在世界范围内广泛发生的土传病害,严重影响世界各国的农业生产,造成巨大的经济损失,病原是辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)。辣椒疫霉菌是一种土传卵菌,以卵孢子或厚垣孢子在土壤病残体中越冬,可以存活数月甚至更长时间,在适宜条件下引起青椒茎腐、根腐和枯萎;寄主范围广,除侵染辣椒外,还可以侵染西葫芦、黄瓜、番茄等20多种作物。目前,对于辣椒疫病的防治主要采用化学防治,而培育抗病品种效果不稳定,原因之一是辣椒疫霉具有较强的变异能力。因此,探索辣椒疫霉菌重要的致病因子,研究抗病性生理生化机制,结合抗病性遗传,抗病基因的QTL定位(quantitative trait loci)与基因工程,进行抗病性鉴定和抗病育种方面研究成为病害防治的前景。其中细胞壁降解酶在病害致病关键因子之一,包括角质酶(cutinase),果胶酶(pectinase),纤维素酶(cellulase),半纤维素酶(hemicellulase),蛋白酶(protease)等。而果胶酶又包括多聚半乳糖醛酸酶(PG),果胶甲基酯酶(PME),果胶裂解酶(PL)。果胶甲基酯酶(PME)是许多植物病原菌分泌的一种果胶酶,能降解植物细胞壁,许多病原真菌,卵菌,细菌在侵染过程都能分泌果胶甲基酯酶。本文以辣椒疫霉菌为研究对象,克隆辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因及表达研究。以辣椒疫霉强致病和果胶甲基酯酶活性高的菌株为实验材料构建的DNA文库,借助Pool-PCR技术分离了4个果胶甲基酯酶基因。对基因结构分析发现4个pme基因具有很高的同源性,并具有不同数目的糖基化位点。所编码的蛋白具果胶甲基酯酶的保守序列和蛋白活性位点。本研究发现,辣椒疫霉pme基因与卵菌pme基因具高度保守序列,也证明了卵菌在自然界中的分类地位。并且对其中一个基因构建质粒进行体外诱导表达,制备了多克隆抗体,借助蛋白印记杂交验证了重组蛋白的免疫活性,其具体研究结果如下:1、Pool-PCR法筛选基因文库,分离了4个果胶甲基酯酶基因从GenBank中下载若干pme基因,同源比对设计多对引物( P230+ AP650,P230+ P920,P230+ P795,P445+ P920,P445+AP650, P620 + P920 ,P650+P920,P445+ P795),然后进行反复筛选,分离了3个全长和1个非全长基因。利用引物P230+AP650筛选出pcpme6,P650+P920筛选出pcpme7和pcpme8,其中P445+P920和P445+P795均能扩增出pcpme9。将所克隆的4个基因经过blast,显示全部为果胶甲基酯酶基因。经过DNAman软件处理分析了这4个基因的基本结构,最大开放阅读框长度差别不大,均在1100bp左右,编码345-348个氨基酸,预测氨基酸分子量为37-38kDa。利用http://www.expasy.org和http://www.cbs.dfu.dk/service/signalP对这四个基因的信号肽和N糖基化位点进行预测,信号肽长度16-20个氨基酸不等,N-端糖基化位点4-7个不等,4个基因的理论PI值为5-9。2、RACE技术扩增pcpme9的3’端将辣椒疫霉菌置于叁角瓶进行振荡培养7天后,收集菌丝。然后液氮研磨,利用Trizol法提取总RNA,经反转录酶作用,合成cDNA,作为模板,以通用引物(USP)和基因特异引物(GSP)进行第一轮PCR;以第一轮产物做模板,用巢式特异引物(NGSP)和巢式通用引物(NUSP)进行第二轮PCR,目的片段回收,连接,转化大肠杆菌DH-5α后,送样测序。将测序片段拼接后,对其进行了初步分析,果胶甲基酯酶基因pcpme9序列全长为1041 bp,最大开放阅读框ORF为1038bp(1-1038),ORF编码一个346个氨基酸的蛋白质,预测编码产物大小约为38kDa,并有7个N糖基化位点,信号肽含16个氨基酸。3、pcpme6真核表达和Western blot根据已经克隆的pcpme6基因序列,设计特异性引物,PCR扩增其成熟肽片断。重组至酵母分泌型表达载体pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K/pcpme6,转化至大肠杆菌JM109中,筛选得到阳性克隆。重组质粒经stuⅠ线性化后转化毕赤酵母GS115感受态细胞,经G418筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到数株基因工程酵母菌。SDS-PAGE分析发现,重组蛋白进行了特异表达,分子量大小为50KDa左右。通过将酵母分泌的PME蛋白免疫家兔,制备特异性抗体。Western blot分析结果进一步表明,转基因酵母成功表达,重组抗原有良好的免疫活性,多克隆抗体具有较高特异性和灵敏度,重组蛋白与制备的抗体特异性结合。(本文来源于《山东农业大学》期刊2008-05-01）
果胶甲基酯酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
果胶是植物细胞壁的主要成分之一,其结构和功能与酯化程度密切相关。PME使果胶去甲酯化形成果胶酸和甲醇,果胶甲基酯酶抑制蛋白(PMEI)抑制PME活性。研究发现BR信号能够调节细胞壁果胶甲酯化状态,而果胶甲酯化状态亦能反馈调节BR信号传递。虽然已有大量研究表明BR在植物生长发育中具有重要作用,然而细胞壁果胶及其甲酯化变化在BR作用下对生长发育的影响及其机理尚不明确。本论文以拟南芥为材料,通过分子生物学与遗传学的方法,研究了PME41和PMEI7在BR调节植物生长和发育中的作用及其相互关系。本论文主要得到以下研究结果:1.构建了35S::PME41植物表达载体,并将其转入拟南芥Col-0野生型获得了PME41基因过表达(oxPME41)转基因植株,通过人工杂交的方法,获得了BR合成突变体det2与oxPME41的杂交植株oxPME41/det2以及det2与pme41突变体的杂交植株pme41/det2,分析了不同基因型植物中的PME活性。结果显示,与非转基因植株相比,oxPME41和oxPME41/det2的PME活性升高,表明PME41在植物中具有果胶甲基酯酶活性。然而,与野生型相比,pme41突变、det2突变体以及pme41/det2中的PME活性均没有显着变化,表明PME41对组织整体的PME活性没有显着贡献。2.构建了PME41-pro::GUS的植物表达载体,并将其转入拟南芥Col-0野生型获得了PME41-pro::GUS转基因植株,分析了PME41的组织表达特异性。结果显示,12天幼苗中,GUS在子叶、真叶、根的成熟去和伸长区中表达量较高,而在下胚轴、叶柄、根尖的根冠和分生区中表达量极低。萼片、花柱中均能检测到GUS的表达,而在花瓣、花药以及柱头上几乎没有表达。随着花发育时期的变化,第13、14期花丝里的表达增强。这些结果表明PME41在植物的不同组织中表达量有较大差异,可能在花丝发育中具有重要的作用。3.构建了35S::PMEI7植物表达载体,并将其转入拟南芥Col-0野生型获得了PMEI7基因过表达(oxPMEI7)转基因植株,通过人工杂交的方法,获得了BR合成突变体det2与oxPMEI7的杂交植株oxPMEI7/det2,分析了转基因对PME活性的影响。结果显示,oxPMEI7中的PME活性降低,oxPMEI7/det2中的PME活性变化不大。结果说明PMEI7具有果胶甲基酯酶抑制蛋白活性,但其抑制作用可能与BR相关。4.分析了PME41、PMEI7和BR合成突变对拟南芥根的生长的影响。结果发现,与Col-0野生型相比,det2显着抑制根的生长,具有极短的根,而pme41突变体、PME41或PMEI7过表达植株的根长均与野生型相近。有意思的是,pme41/det2、oxPME41/det2和oxPMEI7/det2的根长均显着大于det2,部分修复了det2突变体的生长缺陷表型。对PME41/PMEI7修复det2根生长的机理进行了初步分析,发现pme41/det2、oxPME41/det2和oxPMEI7/det2的根尖伸长区细胞明显地比det2长,进而影响根的伸长,这可能是引起它们根长变化的主要原因之一。5.分析了PME41、PMEI7和BR合成突变对拟南芥不同发育时期的影响。结果发现,与det2相比,pme41/det2、oxPME41/det2和oxPMEI7/det2表现出莲座叶变大,花序分枝数增加,果荚变小,种子体积增大,数量减少等表型。对PME41/PMEI7降低det2育性的机理进行了初步探讨,发现pme41、oxPME41或oxPMEI7不影响det2的花粉粒活性和花粉管长度,而花丝长度的统计发现pme41/det2、oxPME41/det2和oxPMEI7/det2的花丝较短,这可能是引起拟南芥长角果大小变化的主要原因。6.qPCR的分析结果表明,BR合成相关基因DET2,CPD和DWF4的表达在pme41,oxPME41以及oxPMEI7植株中有不同程度的下调作用;反过来,在BR的不同突变体det2,dwf4和bri1-116中,一些PME和PMEI基因有不同程度的上调作用,可见果胶甲酯化修饰基因的变化与BR合成基因之间存在密切的关系。此外,相比于在det2中的表达,生长相关基因PRE1及SAUR-AC1在pme41/det2、oxPME41/det2和oxPMEI7/det2中的表达均有不同程度的下调,并且保持相对稳定的状态。以上结果表明内源BR水平的变化与PME和PMEI之间存在复杂的关系。本论文通过分析PME41和PMEI7基因在拟南芥中的作用,研究了细胞壁果胶甲酯化变化对生长发育的影响。结果表明,在内源BR水平正常情况下(Col-0野生型),细胞壁果胶甲酯化变化对生长发育影响不大;但在内源BR水平较低时(det2,BR合成突变),细胞壁果胶甲酯化的改变(甲酯化或去甲酯化)能激活BR信号传递途径,部分恢复BR水平降低导致的生长缺陷,并产生一些特殊的生物学功能。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
果胶甲基酯酶论文参考文献
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