论文摘要
背景与目的:生物正交反应使指能够在生物体内与目标分子高选择性反应,而与周围的生物分子互不干扰的一类化学反应。其具有反应条件温和,选择性高,生物兼容性良好等特点,被广泛应用于检测、标记生物大分子。Sonogashira反应是指钯催化的末端炔基与sp2型碳的卤化物之间的交叉偶联反应。随着近些年的不断探索,Sonogashira反应条件变得更加温和,甚至可以在水相体系中高效进行。非天然核苷,如BrdU 5-溴脱氧尿嘧啶核苷,可以在细胞增殖S期插入新合成的DNA中,随后通过抗体检测增殖的细胞。但此方法中抗体检测特异性不高,操作复杂需要反复洗脱。且需要用盐酸使细胞变性,无法与其他方法实现共同染色。BrdU属于sp2型碳的卤化物,是潜在的Sonogashira反应的底物。因此我们希望可以探索出一种生物正交Sonogashira反应条件,来实现BrdU与含末端炔烃的荧光探针的结合,直接标记BrdU,从而替代抗体反应检测细胞增殖。研究内容:（1）荧光染料的合成:合成末端为炔烃的荧光探针,用于与BrdU发生Sonogashira反应。拟合成罗丹明类和香豆素类两类探针,分别合成末端为芳香炔烃和脂肪炔烃的两类探针,并测量其荧光光谱数据。（2）Sonogashira反应的优化:为使Sonogashira反应成为生物正交反应,我们需要优化使其可以在温和的水相条件下高效进行。采用罗丹明类末端芳炔探针即探针1与BrdU之间的反应作为模板反应,通过优化碱和催化体系来得到最好的反应条件。（3）探针与BrdU的反应:验证上述最佳反应条件的适用性。利用最佳的反应条件进行各类含炔基荧光探针与BrdU之间的Sonogashira反应。并比较他们之间的反应产率与结构的关系。研究结果与讨论:（1）荧光染料的合成:共合成了四种荧光探针,芳香炔烃结尾的罗丹明类探针1,脂肪炔烃结尾的罗丹明类探针3,芳香炔烃结尾的香豆素类探针4,脂肪炔烃结尾的香豆素类探针5。测量四种荧光染料的荧光光谱发现,罗丹明类的最大激发和发射波长都在500nm以上,香豆素类探针的最大激发和发射波长都在400nm。且含芳香末端炔烃探针的都比同类的脂肪末端炔烃探针的最大发生波长长。紫外下,罗丹明类探针呈现粉红色,香豆素类呈现蓝绿色。（2）Sonogashira反应的优化:采用罗丹明类末端芳炔探针即探针1与BrdU之间的反应作为模板反应,先筛选反应所需的碱,发现水溶性碱n-Bu4+OH-的反应活性最高,筛选催化体系发现配体SS-Phos,可以与K2PdC14络合实现较好的催化。筛选到的最佳反应条件为:0.2eq K2PdCl4作为靶催化剂,0.2eq SS-Phos作为配体,溶剂为乙醇:水=1：1,不使用CuI,加入1.5eq的异抗坏血酸钠（防止氧化）。（3）探针与BrdU的反应:应用筛选得到的最佳条件进行其他探针与BrdU的反应,均得到满意的收率。说明此反应条件具有广泛的适用性。比较罗丹明类探针与香豆素类探针的反应活性,罗丹明类的反应要比香豆素类好一些。罗丹明类的芳香末端炔烃比脂肪末端炔烃的反应性好,但香豆素类芳香末端炔烃的反应性却不如脂肪末端炔烃,猜测可能与香豆素芳香末端炔烃的溶解度不太好有关。结论:通过优化得到的Sonogashira反应条件:0.2eq K2PdC14作为靶催化剂,0.2eq SS-Phos作为配体,溶剂为乙醇:水=1:1,不使用CuI,加入1.5eq的异抗坏血酸钠抗氧化。此反应可以作为一种生物正交反应进行含炔基的荧光探针与BrdU之间的标记识别。背景与目的:小分子探针广泛用于标记分离生物大分子中,生物素的标记因可以通过其与亲合素反应进行检测分离而得到广泛应用。Biotin-16-UTP是一种用于实现基因捕获的工业化试剂,可以插入到特定序列中与目的序列配对,随后通过表面附着亲合素的磁珠与生物素结合从而提取出目的基因片段。但是,含有三磷酸基团的核苷酸的合成难度是有机合成界所熟知的,而Biotin-16-UTP的修饰核苷部分又含有超大的链烃及生物素,造成整个分子溶解性极差,合成困难不言而喻。生物正交反应是指能够在生物体内高选择性进行且与生物分子互不干扰的一类化学反应。因其具有反应条件温和,选择性高,生物兼容性良好等特点,被广泛应用于检测、标记生物大分子。我们希望利用生物正交反应来代替生物素与亲合素之间的识别,提高特异性。且生物正交反应的基团一般都较小,相比含生物素基团的Biotin-16-UTP,其更易插入目的序列中,生物兼容性高,并且合成难度也比Biotin-16-UTP小。研究内容:（1）Biotin-16-UTP的合成,期望得到合理可行的合成方法,得到Biotin-16-UTP,探索得到合理的合成路线,还可以指导下一步合成含生物正交基团的探针的合成。（2）含生物正交基团UTP的合成,根据合成Biotin-16-UTP的路线设计合成多种不同长度的含末端炔烃/叠氮生物正交基团的尿苷。（3）三磷酸方法的探索,期望得到原料便宜,方法可行,反应收率较高的三磷酸化方法,用于三磷酸化Biotin-16-尿苷和生物正交基团的尿苷。研究结果与讨论:（1）Biotin-16-UTP的合成:设计了两种合成路线:路线一以尿苷三磷酸为起始原料,碘化后与三氟乙酰基保护的烯丙基胺发生Heck反应,脱三氟乙酰基后与含生物素的活化酯长链缩合成Biotin-16-UTP。但这种方法并未得到目标产物,因此设计了路线二,以碘代尿苷为原料,与三氟乙酰基保护的烯丙基胺发生Heck反应,轻基用TBS保护后进一步降低极性,脱三氟乙酰基后与活化酯不断缩合,先合成Biotin-16-尿苷,最后再进行三磷酸化。这种方式最后引入三磷酸化,增大了中间体的稳定性,大大降低了中间体的极性,易于纯化分离。（2）含生物正交基团UTP的合成:根据合成Biotin-16-UTP的路线二的方法,得到关键中间体TBS保护羟基的烯丙基胺尿苷,然后与不同长度的含末端炔基或叠氮的羧酸直接缩合。得到了连接臂分别为8,10两种长度的末端叠氮的尿苷和连接臂长度分别为8,10,15三种长度的末端为炔基的尿苷。（3）三磷酸方法的探索:采用三氯氧磷与焦磷酸盐成功实现了 Biotin-16-尿苷和连接臂长度为10的末端为炔基的尿苷的三磷酸化。因焦磷酸盐昂贵不稳定,为普及三磷酸化方法,我们自制了 PPN代替焦磷酸盐,并成功实现了三磷酸化。结论:通过先合成Biotin-16-尿苷,最后再进行三磷酸化可以大大降低Biotin-16-UTP的合成难度,并且用同样的方法合成了多种含生物正交基团的UTP探针。利用PPN可以代替焦磷酸盐,与三氯氧磷实现较好的三磷酸化。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 王淑芳
导师: 崔华清
关键词: 生物正交反应,反应,荧光探针,基因捕获,三磷酸的合成
来源: 北京协和医学院
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,化学
单位: 北京协和医学院
分类号: Q503;O657.3
DOI: 10.27648/d.cnki.gzxhu.2019.000756
总页数: 109
文件大小: 7723K
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