非糖基化论文_刘思阳

导读:本文包含了非糖基化论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:丙醛,尿激酶,红细胞,布鲁氏菌,凝血酶,绦虫,脑脊液。

非糖基化论文文献综述

刘思阳^[1]（2018）在《布鲁氏菌P39抗原糖基化与非糖基化免疫原性差异的分析》一文中研究指出布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患的传染病,在世界各地都广泛流行,在发展中国家尤为严重。目前,控制布鲁氏菌病的主要手段是检出捕杀和免疫动物,然而尚无有效的商品化人用疫苗,而动物疫苗多为弱毒苗,具有一定的毒性和致病力,难与自然感染区分开。因此,开发安全有效的疫苗是控制布病的主要研究内容。P39蛋白是羊布鲁氏菌免疫保护候选抗原蛋白,本文以毕赤酵母为宿主表达P39蛋白,对其进行糖基化修饰,探讨其糖基化修饰对重组蛋白免疫原性的影响,为布鲁氏菌新型疫苗的研制奠定基础。方法:对布鲁氏菌优势抗原蛋白P39基因进行克隆,并构建真核表达载体pPICZαA-P39,电转化法转化GS115感受态细胞,Zeocin抗性筛选高拷贝数转化子,优化重组蛋白的表达条件,通过亲和层析方法对目的蛋白进行纯化,分子筛进一步纯化,BCA法检测蛋白浓度,液相色谱法检测其纯度,Western blot免疫印迹法对目的蛋白进行鉴定。利用PNGaseF糖苷酶对重组蛋白进行N端糖链的释放,PAS糖原进行染色,并利用核磁共振氢谱对重组蛋白的糖基化修饰进行分析,确定其糖基化程度。通过巨噬细胞对糖基化蛋白的吞噬作用研究糖基化后的蛋白对细胞识别的影响,通过免疫小鼠实验,检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平、细胞因子分泌水平、IgG特异性抗体水平等实验研究其免疫原性的变化。通过Western Blot检测细胞表面受体TLR-2、MyD88、TRAF6、TLR-4表达情况,探讨蛋白糖基化修饰对免疫信号分子的影响及糖基化影响免疫原性的机制。结果:1.对P39抗原蛋白在毕赤酵母中分泌表达,优化发酵条件发现在pH 6、甲醇诱导浓度为1%、磷酸盐浓度为0.02 M的条件下,诱导时间72h可获得蛋白5.05g/L。亲和层析法对目的蛋白进行纯化,高效液相检测纯化后蛋白纯度可达93.77%。Western blot免疫印迹法对目的蛋白进行鉴定,确定其分子量为45 kDa,与P39抗原蛋白相符。2.利用PNGaseF糖苷酶对重组P39蛋白进行水解,结合核磁共振氢谱结果表明,毕赤酵母表达的P39抗原蛋白被糖基化修饰,且糖基化修饰类型为O-糖基化。3.将毕赤酵母表达的重组蛋白免疫小鼠,MTT法检测脾淋巴细胞增殖结果发现,重组P39蛋白和原核P39蛋白均可显着促进脾淋巴细胞的增殖,但重组后的P39蛋白促脾淋巴细胞增殖的作用明显高于原核P39蛋白。检测小鼠血液中特异性IgG抗体变化发现,在免疫小鼠4-6周的时间内均能检测到较高水平的抗体IgG,真核表达的P39蛋白IgG抗体表达水平在5周时能达到峰值,且峰值略高于原核P39蛋白。通过检测细胞上清中细胞因子的分泌水平结果发现,重组的P39蛋白刺激细胞产生IFN-γ、IL-2细胞因子的水平高于原核蛋白组,说明重组的P39蛋白可能会更好的激活Th1型细胞免疫水平。4.巨噬细胞吞噬荧光标记的重组蛋白和原核蛋白,结果表明巨噬细胞对重组P39蛋白的捕获吞噬作用明显,且用时较短,说明重组的P39蛋白更易被巨噬细胞识别捕获。上述结果说明糖基化修饰后的蛋白其免疫原性明显高于未修饰蛋白。Western Blot检测细胞表面各类受体表达结果表明,毕赤酵母重组的P39蛋白与原核表达的P39蛋白均可引发细胞表面受体TLR-2、TRAF6、TLR-4表达,相对原核P39蛋白,糖基化蛋白可提高TLR-4受体及TRAF6信号分子的表达,说明糖基化的修饰后的蛋白可诱发机体产生部分天然免疫,可能是通过TLR-4受体,调节TRAF6信号途径。结论:通过对小鼠免疫原性的初步探索,研究发现真核P39蛋白和原核P39蛋白都可以刺激机体产生较强的免疫反应,能分泌大量的IFN-γ细胞因子,有效促进细胞免疫水平,脾淋巴细胞增殖实验发现糖基化修饰后的P39蛋白能显着促进淋巴细胞的增殖,且糖基化修饰的蛋白免疫后的小鼠抗体水平以及细胞因子水平均高于原核P39蛋白,糖基化修饰能提高P39蛋白的免疫保护力,可能是诱导了TLR-4受体信号途径,增强天然免疫水平。这为糖修饰P39蛋白作为布鲁氏菌疫苗候选抗原奠定了实验基础。(本文来源于《吉林农业大学》期刊2018-04-01）

黄文斌^[2]（2012）在《包含CD43非糖基化位点的JL1抗原决定簇可作为不成熟/肿瘤性朗格罕氏细胞的标记物》一文中研究指出外科病理中,朗格罕氏细胞组织细胞增生症(LCH)与朗格罕氏细胞(LC)的非肿瘤性反应性增生的鉴别非常困难。尽管以前研究显示Langerin在LCH的诊断中具有临床价值,然而其也可表达于非肿瘤性LCs中,因而需要更加特异性的诊断标记物。JL1抗原是通过针对胸腺细胞开发的抗体而首先发现并被证实为一种新的分化抗原,仅见于造血细(本文来源于《临床与实验病理学杂志》期刊2012年09期）

郝素娟,汪音爵,康爱君,刘永东,李秀男^[3]（2010）在《非糖基化促红细胞生成素的聚乙二醇定点修饰及修饰产物性质》一文中研究指出临床用重组人促红细胞生成素(rhEpo)是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)表达的糖蛋白,糖基对稳定蛋白的结构和生物活性非常重要,但CHO表达体系生产成本高、产量低.以大肠杆菌表达的促红细胞生成素为非糖基化蛋白(rh-ngEpo),对其进行聚乙二醇(PEG)修饰可以提高蛋白稳定性和体内循环半衰期.本文采用分子量为20000的N-末端专一性的单甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)修饰rh-ngEpo,对影响修饰反应的因素进行了考察.结果表明,在最佳反应条件下,单修饰率可达55%.修饰混合物经离子交换层析分离,获得了纯度大于95%的单修饰产物,其二、叁级结构证明与原蛋白相似.肽图分析结果表明,PEG绝大部分修饰在蛋白N-末端的氨基酸残基上.ELISA分析表明,单修饰产物的体外活性虽然比修饰前减少30%,但热稳定性得到显着增强,在SD大鼠体内的药代动力学性质得到显着提高.研究结果表明,PEG可以在一定程度上替代糖基的作用,PEG修饰的非糖基化Epo有望成为一种新型的促红细胞生成蛋白药物.(本文来源于《高等学校化学学报》期刊2010年11期）

郝素娟^[4]（2010）在《重组人非糖基化促红细胞生成素的聚乙二醇定点修饰研究》一文中研究指出促红细胞生成素(Epo)是一种促进红系造血前体细胞分化、繁殖的细胞因子,在临床上主要用于治疗慢性肾功能衰竭(CRF)、艾滋病人及肿瘤病人化疗引起的贫血等,疗效极为显着。Epo是一种含有166个氨基酸的糖蛋白,糖基对于蛋白质的稳定性维持和体内活性至关重要。目前临床使用的重组人促红细胞生成素(rhEpo)均为中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的糖蛋白,但CHO表达体系生产成本高、产量低,而大肠杆菌表达系统具有生长速度快、周期短、培养条件简单、价格低廉等优点。虽然以大肠杆菌表达的无糖链促红细胞生成素(rh-ngEpo)丧失了体内生物活性,但是这一点可以通过PEG修饰技术来弥补。PEG修饰通过减少肾清除、降低免疫原性、减少酶解等改善蛋白药物的药代动力学性质,提高蛋白药物的循环半衰期,增强体内药效,目前已成功用于多种蛋白药物的长效制剂研发。为实现对蛋白质N末端的定点修饰和提高蛋白修饰后的活性保留,本论文采用分子量为20 kDa和30 kDa的单甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)对rh-ngEpo进行修饰。论文考察了各种反应条件对修饰效果的影响,得到了最佳反应条件,即在4℃时,20 mmol/LPB,0.5 mol/L甘露醇,pH 6.0溶液中,蛋白浓度为1 mg/mL, PEG/rh-ngEpo摩尔比为10：1,NaBH3CN/PEG摩尔比为10：1,反应24 h后,单修饰率可达到55%。用一步离子交换色谱法对反应混合物进行分离纯化,得到纯度在95%以上的单修饰产物。对单修饰产物理化性质和修饰位点进行研究,发现其二、叁级结构与原蛋白一致。肽图分析表明绝大部分的PEG修饰在了蛋白N-末端氨基酸残基上。ELISA活性分析表明单修饰产物的体外活性比修饰前分别减少了30%和45.6%。稳定性实验表明PEG修饰显着增强了原蛋白的热稳定性。药代动力学实验结果表明PEG提高了rh-ngEpo的代谢稳定性。综上所述,我们优化了mPEG-ALD修饰rh-ngEpo的最佳反应条件,有效分离出单修饰产物,确定了偶联产物的结构、理化性质及药代动力学性质,研究结果表明PEG可以在一定程度上替代糖基的作用。PEG修饰的非糖基化Epo有望成为一种新型的促红细胞生成蛋白药物。(本文来源于《北京化工大学》期刊2010-06-22）

何庆^[5]（2009）在《糖基化与非糖基化Onconase在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达、纯化与活性鉴定》一文中研究指出Onconase,也称作P-30蛋白,是一种提取自北极豹蛙胚胎的强碱性核糖核酸酶。它由104个氨基酸组成,氨基酸序列与叁维结构分析显示它属于牛胰腺核糖核酸酶A超家族。但Onconase与RNase A也存在不同之处:(1)Onconase含有牛胰腺核糖核酸酶A超家族特有的Cys87-cys104二硫键,该二硫键使其C端残基折向中央的β折叠片而形成了onconase特有的结构(2)Onconase的N端含有焦谷氨酸残基。该非编码的残基是由当Onconase N端的谷氨酰胺暴露时自动环化形成的。该环化结构为Onconase生物活性所必须的结构。Onconase对肿瘤细胞具有细胞毒性和细胞抑制性,能够较好地抑制裸鼠体内移植肿瘤细胞的生长。尽管其细胞毒性的机理仍未完全搞清楚,但Onconae的阳离子性和核糖核酸酶抑制剂的不亲合性是其具有细胞毒性的重要原因。阳离子性能够使Onconase与肿瘤细胞的表面阴离子结合,核糖核酸酶抑制剂的不亲合性能够使通过胞吞作用进入细胞质内的Onconase降解靶RNA(主要是tRNA)。抑制蛋白质生物合成最终导致肿瘤细胞凋亡。最近有文献报道,非编码RNA也与Onconase介导的细胞凋亡有关。目前临床上使用的Onconase均为从北极豹蛙的卵细胞中提取,纯化过程费时又耗力,包括:排卵、提取卵母细胞、体外授精、匀质化、阴离子交换层析、阳离子交换层析和分子筛等步骤。重组DNA技术为许多治疗性蛋白的生产提供了一种有效的替代方法。文献报道利用大肠杆菌表达系统表达的Onconase不能够正确折迭,表达产物最终以包涵体的形式分泌。另外,利用大肠杆菌表达的Onconase在其N端含有多余的Met,该残基阻止了Onconase N端环形结构的形成。为了获得有活性的Onconase,必须对包涵体进行变性、复性和去除N端Met的复杂操作,利用大肠杆菌表达Onconase的产量约为5-50 mg L-1培养基。本研究包括以下3方面的内容:(1)优化Onconase的表达:韩国的Kim等利用PHO1作为分泌信号引导Onconase在巴斯德毕赤酵母中表达,但α交配因子是目前巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白时最常用的分泌信号,研究发现选择合适的分泌信号对于外源蛋白的表达量会产生很大的影响。因此,优化分泌信号是提高Onconase在巴斯德毕赤酵母中表达量的有效方法。(2)评价巴斯德毕赤酵母是否是大规模生产Onconase的最佳宿主:Onconase在巴斯德毕赤酵母中的表达量约为10 mg L-1左右,该表达量与利用其他表达系统时相当。然而,已有大量文献证实采用高密度发酵培养能够将外源蛋白的表达量提高10倍。Onconase具有稳定的化学结构,而对多种蛋白酶的钝化作用使其能够在发酵上清中达到很高的浓度。(3)糖基化和非糖基化形式Onconase活性的比较:过去曾认为糖基化能够增加Onconase结构的稳定性,因此提高了Onconase对K-562的细胞毒性。然而,最新的研究证明onconase的细胞毒性和细胞抑制性主要取决于它的核糖核酸酶活性,因此,糖基化能否提高Onconase细胞毒性需要在正常细胞和其他肿瘤细胞中进一步证实。该研究证明了在巴斯德毕赤酵母中最常用的α交配因子分泌信号并非是Onconase的最适分泌信号:当利用不含EAEA空间结构的α交配因子作为分泌信号时,α交配因子的pro肽部分不能被Kex2蛋白酶从Onconase中正常切除,从而导致表达产物为未经加工的高度糖基化的Onconase前体;当利用含EAEA空间结构的α交配因子作为分泌信号时,α交配因子的pro肽部分能够完全被Kex2蛋白酶从Onconase中正常切除,但是,EAEA空间结构却不能被Ste13蛋白酶从Onconase中切除,导致了Onconase的N端带有多余的空间结构,阻止了其N端环形结构的形成,最终使表达产物没有生物学活性。对于一些N端具有特殊结构的外源蛋白来说,pro肽或EAEA空间结构的不完全切割往往是造成其表达量低或表达产物没有生物学活性的主要原因,然而,目前对于这类蛋白遇到的问题,还没有统一的解决办法。该研究利用α交配因子的pre肽部分作为分泌信号时,目的蛋白产量高,纯化过程简单,且具有良好的生物活性,说明α交配因子pre肽部分的信号肽酶对于Onconase的N端特殊结构不敏感。为上述问题提供了一种解决方法。该策略同样可以用于面临相同问题的其他外源蛋白。通过分泌信号的优化,我们证明了巴斯德毕赤酵母是大规模制备Onconase的最佳宿主。然而,由于糖基化形式对药物免疫原性和药代动力学具有一定的不利影响,因而对于糖基化形式Onconase的应用目前尚还存在很大的争议和不确定性。因此,对于糖基化形式Onconase的研究,还有大量的试验验证需要展开。(本文来源于《中国人民解放军军事医学科学院》期刊2009-06-15）

杨波,李天德,王广义,陈练^[6]（2007）在《非糖基化尿激酶原突变体的研究》一文中研究指出目的:构建一种非糖基化、抗凝血酶激活的尿激酶原突变体,在CHO-dhfr-(二氢叶酸还原酶缺陷型-中国仓鼠卵巢)细胞中表达,收取无血清培养上清,并鉴定其活性。方法:使用PCR扩增的方法,将302位天冬酰胺(Asn302)突变为丙氨酸(Ala302),去掉糖基化位点;将156位精氨酸(Arg156)突变为赖氨酸(Lys156),去掉凝血酶作用位点。将突变体基因转染到CHO-dhfr-细胞中。收取无血清培养上清,并用纤维蛋白板溶解圈法鉴定活性。结果:PCR产物经琼脂糖电泳鉴定分子量略大于1200道尔顿(dalton),与理论分子量1296道尔顿符合。转染成功的细胞株用于扩大培养。纤维蛋白板溶解圈法测定上清活性为295.58IU/ml。结论:非糖基化、抗凝血酶的单链尿激酶型纤溶酶原激活剂突变体构建成功。转染后细胞生长良好,表达水平较高。(本文来源于《心血管康复医学杂志》期刊2007年03期）

杨波,李天德,陈惠鹏,胡显文,胥照平^[7]（2007）在《非糖基化尿激酶原的研究》一文中研究指出目的:构建一种非糖基化、抗凝血酶激活的尿激酶原突变体,并观察其表达及活性情况。方法:使用PCR扩增的方法,将302位天冬酰胺(Asn302)突变为丙氨酸(Ala302),去掉糖基化位点;将156位精氨酸(Arg156)突变为赖氨酸(Lys156),去掉凝血酶作用位点。将突变体基因转染到哺乳动物细胞中。收取无血清培养上清,并用纤维蛋白板溶解圈法鉴定活性。结果:PCR产物经琼脂糖电泳鉴定分子质量略大于1200bp,与理论分子质量1296bp基本符合。转染成功的细胞株用于扩大培养。纤维蛋白板溶解圈法测定上清活性为295.58IU/mL。结论:非糖基化、抗凝血酶的尿激酶原突变体构建成功。转染后细胞生长良好,表达水平较高。(本文来源于《天津医药》期刊2007年02期）

杨波^[8]（2005）在《重组非糖基化尿激酶型纤溶酶原激活剂的研究》一文中研究指出目的 构建非糖基化、抗凝血酶激活的高分子量尿激酶原突变体。 方法 使用PCR扩增的方法,将302位天冬酰胺(Asn302)突变为丙氨酸(Ala302),去掉糖基化位点;将156位精氨酸(Arg156)突变为赖氨酸(Lys156),去掉凝血酶作用位点。 结果 PCR产物经琼脂糖电泳鉴定分子量为1296Da(道尔顿,dalton)。突变体与pUC19克隆载体用HindⅢ、XbaⅠ双酶切。二者连接后,转化入DH5α感受态细胞(大肠杆菌)中。用蓝白斑筛选法识别PCR产物是否与pUC19载体连接。包含PCR产物的克隆呈现白色。将白色克隆提质粒送测序。测序正确的基因与pIPES双表达载体连接后备用。 结论 非糖基化抗凝血酶的高分子量尿激酶原突变体构建成功。(本文来源于《中国人民解放军军医进修学院》期刊2005-05-01）

马长玲^[9]（2000）在《猪带绦虫2个非糖基化多肽的鉴定》一文中研究指出猪带绦虫6种主要多肽——100,70,50,42,35及24kDa可通过免疫沉淀反应被血清呈阳性患者脑脊液中的抗体识别。其中70,35kDa多肽与抗体反应特异性较高。 免疫沉淀法常用于鉴定被神经型囊尾蚴病患者免疫球蛋白识别的猪带绦虫特异性抗(本文来源于《国外医学(寄生虫病分册)》期刊2000年02期）

张淑敏,郑婧^[10]（1999）在《糖基化和非糖基化G-CSF治疗患者化疗后骨髓抑制的临床作用比较》一文中研究指出目的：糖基化与非糖基化Ｇ－ＣＳＦ对化疗后骨髓抑制引起的白细胞减少均有较好的预防作用。方法：２４例经病理学证实的恶性肿瘤患者（肺癌、胃肠癌、淋巴瘤、乳腺癌）于化疗后分别给予两种Ｇ－ＣＳＦ治疗，对两种药物的效果进行了比较。结果：较低剂量的糖基化Ｇ－ＣＳＦ似有更好的疗效，虽无统计学上意义，但价格上明显低于非糖基化Ｇ－ＣＳＦ。结论：临床上更推崇使用糖基化Ｇ－ＣＳＦ。(本文来源于《中国肿瘤临床》期刊1999年06期）

非糖基化论文开题报告

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

外科病理中,朗格罕氏细胞组织细胞增生症(LCH)与朗格罕氏细胞(LC)的非肿瘤性反应性增生的鉴别非常困难。尽管以前研究显示Langerin在LCH的诊断中具有临床价值,然而其也可表达于非肿瘤性LCs中,因而需要更加特异性的诊断标记物。JL1抗原是通过针对胸腺细胞开发的抗体而首先发现并被证实为一种新的分化抗原,仅见于造血细

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

非糖基化论文参考文献

[1].刘思阳.布鲁氏菌P39抗原糖基化与非糖基化免疫原性差异的分析[D].吉林农业大学.2018

[2].黄文斌.包含CD43非糖基化位点的JL1抗原决定簇可作为不成熟/肿瘤性朗格罕氏细胞的标记物[J].临床与实验病理学杂志.2012

[3].郝素娟,汪音爵,康爱君,刘永东,李秀男.非糖基化促红细胞生成素的聚乙二醇定点修饰及修饰产物性质[J].高等学校化学学报.2010

[4].郝素娟.重组人非糖基化促红细胞生成素的聚乙二醇定点修饰研究[D].北京化工大学.2010

[5].何庆.糖基化与非糖基化Onconase在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达、纯化与活性鉴定[D].中国人民解放军军事医学科学院.2009

[6].杨波,李天德,王广义,陈练.非糖基化尿激酶原突变体的研究[J].心血管康复医学杂志.2007

[7].杨波,李天德,陈惠鹏,胡显文,胥照平.非糖基化尿激酶原的研究[J].天津医药.2007

[8].杨波.重组非糖基化尿激酶型纤溶酶原激活剂的研究[D].中国人民解放军军医进修学院.2005

[9].马长玲.猪带绦虫2个非糖基化多肽的鉴定[J].国外医学(寄生虫病分册).2000

[10].张淑敏,郑婧.糖基化和非糖基化G-CSF治疗患者化疗后骨髓抑制的临床作用比较[J].中国肿瘤临床.1999

论文知识图

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