海洋真菌中抗菌活性菌株的筛选及木贼镰刀菌Fusarium equiseti中eqxR基因过表达

论文摘要

海洋来源真菌生长于高吐压、低营养、低温、含盐海水环境中,形成了耐饥、耐盐、耐碱的独特生态特性和适应机制,产生不同于陆生微生物次生产物代谢产物。海洋来源真菌因可规模化培养引起药物学家的关注。海洋真菌的次生代谢产物类型主要包括生物碱、聚酮、肽类、甾体、萜类、等。多数化合物表现出抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等生物活性。目前全球抗菌药物不合理的使用加速了超级耐药细菌的产生,新一代抗生素的开发迫在眉睫。现有的抗生素绝大多数是从土壤源微生物中筛选获得,为了获得新型抗生素,海洋来源的抗生素引起了人们的极大兴趣海洋来源的天然产物较陆地来源的具有更新颖的结构、更强的活性,为发现更理想的抗菌先导化合物提供物质基础。本文建立一种快速筛选具有抗菌活性的真菌方法,设计并改良了一种双层琼脂板快速筛选方法利用改良双层琼脂板筛选法,从20株海洋来源的真菌中快速筛选获得一株具有显著抗菌活性的菌株WZXY-33-10,通过鉴定活性菌株为Fusarium equisetin并通过现代色谱学及波谱学方法从其发酵物中分离鉴定了 2个抗菌活性化合物equisetin（1）和epi-equisetin（2）能特异性杀灭多种多重耐药的革兰氏阳性菌,并对equisetin合成基因簇进行改造,得到equisetin高产菌株。随着DNA测序技术发展,许多新合成基因簇被发现,在这些微生物的次生代谢相关基因中,主要包括编码次级代谢途径的基因和调控基因,根据基因组序列分析,能够确定基因编码的酶所催化的化学反应,为我们有目的的进行基因改造。本文通过二代测序技术对这株Fusarium equiseti木贼镰刀菌进行全基因组测序,获得该株菌中equisetin生物合成基因簇的详细信息;分析各基因或结构域在equisetin合成过程中的功能,根据文献报道,对合成基区簇的调节因子eqxR进行过表达,通过PEG/CaC12介导原生质体遗传转化技术,对eqxR基因进行研究转化,从而获得突变菌株。

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摘要

Abstract

1 绪论

1.1 海洋来源真菌的次生代谢产物研究进展

1.1.1 海洋沉积物来源真菌的天然产物研究

1.1.2 海洋植物来源真菌的天然产物研究

1.1.3 海洋动物来源真菌的天然产物研究

1.1.4 其他来源真菌的天然产物研究

1.2 Equisetin及其衍生物的研究进展

1.2.1 概述及结构特征

1.2.2 Equisetin生物活性

1.2.2.1 抗菌活性

1.2.2.2 HIV抑制剂

1.2.2.3 植物毒性

1.2.3 Equisetin化学合成

1.2.4 equisetin生物合成途径的研究

1.3 真菌的遗传转化

1.3.1 基因的表达

1.3.2 原生质体用于丝状真菌遗传转化

2介导的遗传转化方法'> 1.3.3 PEG/CaCl₂介导的遗传转化方法

1.4 本课题来源及研究意义

1.4.1 课题来源

1.4.2 本课题研究的目的与意义

1.4.3 论文的研究内容

2 海绵共生真菌中抗菌活性菌株的筛选

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.1.1 实验菌株

2.2.1.2 实验试剂

2.2.1.3 实验仪器

2.2.2 实验方法

2.2.2.1 细菌的选择

2.2.2.2 真菌培养方法

2.2.2.3 双层琼脂板筛选法

2.2.2.4 活性菌株的菌种鉴定

2.2.2.5 提取及检测方法

2.2.2.6 抗菌活性菌株的发酵及化学分离

2.2.2.7 细菌的培养

2.2.2.8 抗菌活性测定

2.3 实验结果

2.3.1 抗菌活性菌株的筛选

2.3.1.1 真菌的鉴定

2.3.2 化学成分分析

2.3.2.1 抗菌活性成分的结构鉴定

2.3.2.2 化合物的抗菌活性

2.3.2.3 耐药菌活性检测

2.4 本章小结

3 eqxR基因过表达

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1.1 实验试剂

3.3 实验方法

3.3.1 生物信息学的分析

3.3.2 eqxR-overpression载体的构建

3.3.2.1 溶液的配置

3.3.2.2 引物设计

3.3.2.3 目的片段的扩增

3.3.2.4 PCR产物纯化

3.3.2.5 闪电克隆构建载体

3.3.3 转化感受态细胞并挑选单克隆菌落

3.3.3.1 制备感受态细胞

3.3.3.2 将连接产物进行转化

3.3.3.3 OMEGA试剂盒提取质粒

3.3.3.4 酶切验证

3.3.3.5 载体线性化

3.3.3.6 琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物和PCR产物

3.3.3.7 胶回收目的片段

3.3.4 pAMA1-eqxR载体构建

3.3.4.1 构建pAMA1-eqxR载体引物序列

3.3.4.2 目的片段的扩增

3.3.4.3 3PCR产物纯化

3.3.4.4 目的片段与载体连接

3.3.4.5 转化感受态细胞

3.3.4.6 将连接产物进行转化

3.3.4.7 OMEGA试剂盒提取质粒

3.3.4.8 目的片段的扩增

3.3.4.9 PCR产物纯化

3.3.4.10 目的片段与载体连接

3.3.4.11 将连接产物进行转化

3.3.4.12 OMEGA剂盒提取质粒

3.3.5 真菌遗传转化

3.3.5.1 Fusarium equiseti对潮霉素的敏感性检测

3.3.5.2 木贼镰刀菌原生质体制备条件摸索

3.3.5.3 原生质体制备与转化

3.3.5.4 转化子二次筛选

3.3.5.5 突变株进行基因组DNA提取方法

3.3.5.6 突变菌株基因验证

3.4 实验结果

3.4.1 equisetin生物合成基因簇功能注释

3.4.2 eqxR-overpresssion载体的构建

3.4.3 构建p-AMA1-eqxR载体的构建

3.4.4 Fusarium equiseti对潮毒素的敏感性检测

3.4.5 酶的选择体系对原生质体制备的影响

3.4.6 转化子基因验证结果

3.4.6.1 eqxR-overpresssion线性化载体用于遗传转化的突变株验证

3.4.6.2 p-AMAl-eqxR载体用于遗传转化的突变株验证

3.5 本章小结

4 讨论

4.1 双层琼脂平板法筛选具有抗菌活性的真菌

4.1.1 细菌的选择

4.1.2 双层琼脂平板法建立的高效性

4.1.3 抗菌活性的导向分离

4.2 真菌生物合成

4.2.1 生物信息学分析

4.2.2 丝状真菌过表达体系的探索

4.2.3 潮霉素抗性筛选对转化子的影响

2遗传转化条件的探索'> 4.3 PEG/CaCl₂遗传转化条件的探索

4.3.1 菌丝的生长状态对原生质体产量的影响

4.3.2 酶的选择与配置对原生质体产量的影响

结论

参考文献

附录

附图

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 关鑫

导师: 林文翰

关键词: 海洋真菌,抗菌活性,筛选方法

来源: 哈尔滨商业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 哈尔滨商业大学

基金: 国家自然科学基金青年基金项目(201502004),北京市自然科学基金面上项目(7182086)

分类号: Q933

DOI: 10.27787/d.cnki.ghrbs.2019.000409

总页数: 71

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