导读:本文包含了组合生物合成论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:组合,生物,酵母,糖苷,多拉,血红素,激酶。
组合生物合成论文文献综述
刘晓彤[1]（2019）在《蛋白酶体抑制剂syrbactins的组合生物合成和prenylisatin的异源表达》一文中研究指出微生物是重要药用化合物的主要来源。为挖掘更多抗肿瘤和抗细菌感染的天然活性药物,本文从组合生物合成和基因组挖掘两个角度来对两类化合物开展研究。1蛋白酶体抑制剂类化合物syrbactins生物合成基因簇的挖掘和组合生物合成蛋白酶体(proteasome)负责降解错误折迭、过量的蛋白,是抗肿瘤药物筛选的分子1靶标。短肽类化合物syrbactins家族被认为是新一代蛋白酶体抑制先导化合物。它们的核心骨架(也是活性中心)十二元内酰胺环母核的生物合成机制类似,都由非核糖体肽合成酶(NRPS)-聚酮合酶(PKS)复合体采用模块化组装方式合成,这种机制可以允许利用组合生物合成技术对其聚酮或聚肽骨架结构进行构效优化。本研究目标是通过基因组挖掘得到更多来源的syrbactins生物合成基因簇,通过理性设计和重新组合,建立syrbactins的“人工”生物合成途径,实现syrbactins的构效优化。1.1 Syrbactins家族基因簇的挖掘和异源表达:为了积累更多模块元件,本研究首先利用GenBank等数据库中大量的细菌基因组及宏基因组信息进行挖掘,利用在线程序Blast进行序列比对和分析,利用antiSMASH进行基因簇预测,发现了许多潜在的syrbactins生物合成基因簇,包含以前研究过的glb、syl、lmm(分别合成丁香霉素(syringolins)、滑杆菌素(glidobactins)、cepafungins 和luminmycins等化合物)以及新发现的Pglb(来自荚壳伯克氏菌PG1(Burkholderi 1 glumae PG1))。因在原始菌中未检测到syrbactins家族产物积累,对Pglb基因簇进行直接克隆、异源表达以及进行启动子的原位插入激活等实验,但均未能激活相应基因簇的表达。1.2 Syrbactins家族异源表达宿主的筛选:为便于进行不同基因簇之间组合生物合成,本研究尝试在白色链霉菌J1074(StreptomycesalbuJ1074)、伯克氏菌DSM 7029(Burkholderial(DSM 7029)、天蓝色天霉菌(Streptomycescoelicolor)等几种常用宿主中异源表达syrbactins生物合成基因簇,期望找到最佳适配性的宿主,以有效表达“人工”的syrbactins生物合成基因簇。目前结果发现:白色链霉菌中,syl可以表达,但glb不能表达;天蓝色链霉菌中,syl和glb均不能表达,伯克氏菌中syl不能表达。尚未找到能同时高效表达glb、Pglb和syl叁个基因簇的宿主菌。1.3 Glidobactins生物合成基因簇的阻断与回补:对伯克氏菌DSM 7029基因组上glidobactins生物合成基因glbC和glbF成功进行敲除,获得单基因敲除突变菌株。HPLC-MS分析发现,glbC和glbF敲除突变株没有glidobactins产生,成功阻断了 glidobactins生物合成通路,说明glbC和glbF作为结构基因对glidobactins生物合成非常关键。将构建好的glbC和glbF回补表达质粒电转化到以上敲除突变株中,发现:基因回补后能恢复glidobactins的生产,但产量降低为野生型DSM 7029的10%。1.4 Glidobactins生物合成基因簇结构基因的种间替换:以上面获得的glbC和glbF敲除突变株为基础,尝试利用来自syl以及Pglb基因簇中的同源基因进行结构基因的种间替换(预期发生氨基酸残基的替换):sylD(与glbC同源)、sylC(与glbF同源)和PglbC(与glbC同源)分别导入DSM7029敲除突变株,替换glbC和glbF。HPLC-MS检测发现,种间结构基因替换未能产生杂合化合物。1.5 Glidobactins生物合成基因簇模块和结构域替换:以直接克隆得到的glidobactins生物合成基因簇glb为基础,分别敲除glbC中的第二个模块和该模块中的腺苷酰化结构域A;随后将来源于syl和PglP两个基因簇中的相应的模块和腺苷酰化结构域无痕插入到glbC中,完成模块替换。最后将构建的“人工”生物合成基因簇导入到敲除了glb的DSM 7029进行表达,结果没有预期的杂合化合物产生(仅产生了二肽结构的化合物),说明模块和结构域替换导致glidobactins生物合成通路中断。为了消除不同生物来源的syrbactins生物合成基因簇GC含量以及密码子偏好性的影响,我们对用于替换的模块进行了密码子优化,然后重新进行模块和结构域的替换,结果也没有检测到预期化合物。2异戊烯吲哚类化合物prenylisatin的生物合成Prenylisatin是细菌来源的异戊烯吲哚类化合物,具有抗细菌、抗真菌及细胞毒性等特性,是色氨酸在异戊烯基转移酶的催化作用下,在不同位置发生了异戊烯基取代形成的。虽然目前已经发现一系列异戊烯基转移酶,能对吲哚环上所有非桥头原子(N-1、C-2、C-3、C-4、C-5、C-6和C-7)进行异戊烯化,但这类化合物完整的生物合成通路仍未阐明。本研究目标是利用Red/ET直接克隆技术进行基因组挖掘,鉴定异戊烯吲哚类化合物prenylisatin生物合成基因簇,研究其生物合成途径,为进行更多类似化合物的生物合成奠定基础。2.1 Prenylisatin生物合成基因簇的直接克隆和异源表达:我们利用antiSMASH对放线菌“D74”(Streptomycesrochei)基因组进行基因簇预测,发现此菌株含有大量次级代谢基因簇;对其中沉默的基因簇cluster 2进行直接克隆,导入到天蓝色链霉菌A3(2)(Streptomycescoelicolor A3(2))中。HPLC-MS检测证明:异源表达成功激活该基因簇,该化合物m/z 215.6[M+H]+,与文献报道一致。2.2 Prenylisatin生物合成基因簇中单个基因的功能研究:分别对prenylisatin基因簇中包含的17个基因进行单基因同框缺失突变,获得17个单基因突变菌株,然后进行LC-MS分析。结果表明:叁个基因isa8、iia9和isal0为prenylisatin生物合成途径中的关键基因,缺失后导致目标产物不再积累。同源性分析表明isa8和iia9分别为色氨酸合成酶和芳香族异戊烯转移酶基因。isal0功能不确定(推测编码转录调控因子)。3总结本研究开展系列组合生物合成研究,利用结构基因替换、模块替换及结构域替换,结合密码子优化等,构建系列syrbactins人工生物合成途径,但均未得到预期杂合化合物。Syrbactins化合物是通过NRPS-PKS杂合途径合成的,其中的蛋白质-蛋白质相互作用比单一的NRPS或PKS途径更加难以预测,微小的改变也会对整个生物合成途径产生巨大影响,目前有报道关于NRPS模块替换产生新化合物,但罕有NRPS-PKS杂合基因簇模块替换成功的案例报道。从放线菌基因组上直接捕获了 30 kb的prenylisatin生物合成基因簇,并成功进行异源表达和单基因敲除,鉴定叁个关键基因(编码色氨酸合成酶、芳香族异戊烯转移酶和未知功能蛋白),为异戊烯吲哚类天然活性产物组合生物合成提供重要的基因资源。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-17）
刘岚清,刘宏,张伟,姚明东,李炳志[2]（2019）在《利用异源酶组合构建酿酒酵母中咖啡酸的生物合成》一文中研究指出微生物中构建植物源天然产物的生物合成面临着许多挑战,尤其是当需要表达与激活植物源细胞色素P450酶的时候。通过从几种细菌中筛选HpaB和HpaC两种酶,本文在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中构建了具有活性的4-羟基苯乙酸-3-羟化酶(4HPA3H),它可以发挥植物源细胞色素P450酶的相似作用,用于生产咖啡酸。在与一个共同的酪氨酸氨裂合酶(TAL)协同作用下,不同的异源HpaB酶和HpaC酶组合在将底物L-酪氨酸转化为目标产物咖啡酸上展现出不同能力。以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的HpaB酶和肠沙门氏菌(Salmonella enterica)的HpaC酶的异源酶组合可生产最高咖啡酸产量,摇瓶培养下可达到(289.4±4.6)mg·L–1。酵母底盘细胞与异源酶的相容性得到了有效的改善,咖啡酸的产量比初始值提高了40倍。铜绿假单胞菌HpaB酶中黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合域周围的6个关键氨基酸残基与其他细菌来源的HpaB酶有明显区别,可能在影响酶活性方面起关键作用。综上,我们建立了一种有效的方法来构建高效的酵母系统用于合成非天然羟基苯丙烷类化合物。(本文来源于《Engineering》期刊2019年02期）
吴铮[3]（2017）在《利用基因组合生物合成和代谢工程技术构建庆大霉素B高产菌株》一文中研究指出随着基因工程技术的不断发展,对氨基糖苷类抗生素有了更加深入的了解。经生物合成手段改造的一些生物活性强,低毒性的半合成类氨基糖苷类抗生素成为近年来研究的焦点。庆大霉素B作为2-DOS类氨基糖苷类抗生素,是异帕米星合成的原料药,获得庆大霉素B高产菌株对工业化生产有着重要意义。庆大霉素的生物合成途径已经被阐明,GenK和GenP分别为甲基化酶和磷酸转移酶,本研究中对基因genK和genP同时进行阻断,成功得到了 JI-20A高产菌,JI-20A经氧化脱氨再还原后可形成庆大霉素B。以JI-20A高产菌为出发菌株,将来自卡那霉素产生菌卡那链霉菌的kanJ和kanK进行异源表达,搭配3种不同种类的启动子进行筛选,最终获得了庆大霉素B高产菌。研究还通过代谢工程手段,将糖苷转移酶KanM1和GenM2进行过表达,结合葡萄糖流加的方法将庆大霉素B的产量进一步提高。本实验室之前将genK阻断构建了庆大霉素C1a高产菌株。以此为出发菌株,将糖苷转移酶KanM1和GenM2进行过表达与流加葡萄糖的方法使庆大霉素C1a产量在原有基础上有所提高。糖苷转移酶KanM1和GenM2在Mechinospora中过表达系统的建立实现了初级代谢物向次级代谢物转化,为在细胞内调节改变代谢流提供了现实依据,也为通过调节酶控制初级代谢产物向目标次级代谢产物转化提供了理论基础。(本文来源于《沈阳药科大学》期刊2017-06-01）
吝晓君[4]（2017）在《基因重组藻蓝胆素的组合生物合成及其代谢调控研究》一文中研究指出藻蓝胆素(PCB)是某些藻类所特有的天然色素,由于其特殊的光谱学性质,被作为一种优良的荧光探针分子广泛应用于免疫疾病诊断和光动力治疗等领域。同时,由于其还具有消炎、抗氧化、清除自由基等功能,因此,在食品、化妆品及医药保健品领域同样具有显着的潜在应用价值。然而,目前,制取藻蓝胆素的主要方法是从天然藻类中提取,该方法制备工艺复杂,生产成本高,因此市场上高纯度的藻蓝胆素价格十分昂贵,严重限制了其大规模产业化应用。利用基因工程技术的方法,利用基因重组大肠杆菌生产重组藻蓝胆素制备工艺相对简单、生产成本相对较低,具有大规模制备的潜在价值。本研究利用多基因组合表达技术,在大肠杆菌自身血红素生物合成途径的基础上,以大肠杆菌体内血红素为底物,通过外源导入含有hox1和pcyA基因的不同表达载体,从而在大肠杆菌体内构建藻蓝胆素的生物合成途径,用于重组藻蓝胆素的规模制备。通过导入不同类型表达载体发现,单顺反子表达载体导入两条外源基因,无论在外源导入酶表达量还是PCB产量均优于多顺反子控制两条基因的重组载体。为了进一步提高重组藻蓝胆素的表达量,我们分别研究了heme上游关键基因hemB,hemG,hemH和ALA上游关键基因hemA和hemL,对重组PCB产量及关键中间代谢物的影响。结果发现,heme上游基因hemB,hemG和hemH的过表达会促进中间代谢产物ALA和heme物质的瞬时积累,二者分别可以提高1.49和3.77倍,但由于反馈抑制作用导致ALA和heme的产量不能随时间增加,PCB产量反而有些下降,这可能是由于共转基因在表达时,hox1和pcyA基因受到影响导致Hox1和PcyA催化活性降低引起的。ALA上游基因hemA~s和hemL基因的过表达会促进中间代谢物ALA和heme物质的积累,二者分别提高了2.23和2.18倍,但对PCB的产量影响甚微,可能是由于HemA~s结构稳定,能够削弱heme的反馈抑制原因造成的。此外,我们还研究了增加PCB合成所需的两个关键基因hox1和pcyA的拷贝数对大肠杆菌藻蓝胆素生物合成途径的影响。但是结果发现,增加hox1和pcyA基因的拷贝数可以使两种酶的产量提高,但是没有实现预期PCB产量的增加。这可能是PCB或者中间代谢物存在某种未知的反馈抑制,导致虽然某些中间产物积累,但是最终PCB却没有明显提升,这也同时表明大肠杆菌血红素生物合成途径的复杂性。本研究为进一步明晰大肠杆菌血红素代谢途径,并利用该代谢合成途径生产高附加值产品提供了重要的理论和方法基础。(本文来源于《中国石油大学(华东)》期刊2017-05-01）
邓倩[5]（2017）在《组合生物合成生产双氢多拉菌素》一文中研究指出阿维菌素(Avermectin)为阿维链霉菌(Streptomyces avermimitilis)产生的一类具有杀虫、杀螨和杀线虫活性的十六元大环内酯化合物,其因C5、C22-C23、C25结构不同共分为8个组份,分别为A1a,A1b,A2a,A2b,B1a,B1b,B2a,B2b,主要活性组分为阿维菌素B1a。现市售伊维菌素是在阿维菌素的基础上,利用化学催化的方式选择性地对其C22-C23位加氢得到的二代衍生物。多拉菌素与阿维菌素的区别则在于其起始单元为环己烷甲酰-CoA。本课题组已经通过构建细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)文库成功获取了阿维菌素生物合成基因簇,并在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中异源表达。通过利用梅岭霉素聚酮合成酶Mei A1 M2上的DH-ER-KR结构域替换阿维菌素聚酮合成酶Ave A1 M2上的DH-KR结构域,成功构建了杂合的聚酮合酶以生产伊维菌素。在此基础上敲除aveD基因,得到了只产生伊维菌素B组份的重组菌株S.avermitilis XL316。阿维菌素的起始单元2-甲基丁酰-CoA和异丁酰-CoA分别由L-异亮氨酸和L-缬氨酸经支链氨基酸分解代谢途径产生。L-异亮氨酸和L-缬氨酸首先经支链氨基酸转氨酶催化,生成α-酮酸,再经支链氨基酸脱氢酶(branched-chaina-ketoaciddehydrogenase,BCDH)作用发生氧化脱羧反应,生成2-甲基丁酰-CoA和异丁酰-CoA。由于2-甲基丁酰-CoA和异丁酰-CoA由同一支链氨基酸分解代谢途径合成,为进一步得到单一组份的阿维菌素衍生物,本课题组尝试利用洛伐他汀生物合成基因簇中的lovF,对阿维菌素生物合成基因簇中的起始模块进行替换,以期得到的单一的伊维菌素组份。阿维链霉菌的支链氨基酸脱氢酶仅仅含有E1α、E1β和E2叁个亚基,而在某些真核生物体内还存在两个BCDH调控蛋白,即支链氨基酸脱氢酶激酶(BCDH Kinase)和支链氨基酸脱氢酶磷酸酶(BCDH phosphatase)。这两个蛋白通过对支链氨基酸脱氢酶磷酸化失活,去磷酸化恢复活性,严格控制生物体内的支链氨基酸分解代谢水平。我们通过从真菌中筛选,得到了一个可以在阿维链霉菌体内发挥活性的支链氨基酸脱氢酶激酶(BCDH Kinase),在BCDHKinase1调控的基础上,发酵重组菌株S.avermitilis DQ319,喂养环己基-(N-乙酰-)氨基-乙基-硫酯,成功检测到了双氢多拉菌素,其C22-C23为饱和键,起始单元为环己烷甲酰-CoA,具备伊维菌素和多拉菌素的双重特征。本实验成功筛选了一个可以在原核生物体内发挥活性的BCDHKinase,为真核生物基因在原核生物体内表达提供了实践基础。在BCDH Kinase发挥活性的基础上,首次发酵产生了新化合物双氢多拉菌素。许多天然药物的合成起始单元或者延伸单元都来源于支链氨基酸降解途径。基于此,将BCDH Kinase导入不同的宿主菌,通过特异性地喂养相关前体物或者转入某些前体物的生物合成基因簇,就可以得到多种相关衍生物,为发现活性更好的新药提供新的方法和思路。(本文来源于《武汉大学》期刊2017-05-01）
徐玉泉[6]（2016）在《组合生物合成非天然真菌聚酮活性化合物》一文中研究指出真菌间苯酚大环内酯类聚酮化合物由大环内酯环和间苯酚环桥接而成,具有抗癌、杀线虫、抗疟疾、降血压、抗感染、调节免疫系统和增强植物耐热能力等多种生物活性。真菌聚酮由迭代式聚酮合酶催化生物合成。根据结构域的组成,真菌聚酮合酶可分为还原型聚酮合酶和非还原型聚酮合酶。大多数真菌聚酮只需要一个聚酮合酶催化合成,而间苯酚大环内酯聚酮化合物却需要一对还原型聚酮合酶和非还原型聚酮合酶的协同合成。在间苯酚大环内酯生物合成过程中,来源于不同真菌的还原型聚酮合酶首先合成长度和饱和度不同的中短链脂肪酸中间产物,然后将其转移到非还原型聚酮合酶上进一步合成芳香环和内酯环,形成间苯酚大环内酯同系物。初合成的间苯酚大环内酯骨架一般还需要经过卤化、氧甲基化、环氧化等修饰步骤,最终合成成熟的聚酮化合物。间苯酚大环内酯的这种双聚酮合酶协同及合成后修饰的生物合成策略,适宜作为研究聚酮生物合成的模式系统,用于深入研究真菌聚酮合酶的程序化生物合成机制和研发定向组合生物合成新型聚酮化合物的方法。利用基因克隆和功能分析等方法,在酵母异源生物合成系统中重构了间苯酚大环内酯根赤壳霉素(radicicol)、毛色二孢霉素(lasiodiplodin)、雷羧酸内酯(resorcylide)和脱氢弯孢霉素(dehydrocurvularin)双聚酮合酶协作的生物合成途径;阐明了非还原型聚酮合酶的产物模板结构域催化间苯酚大环内酯芳香环折迭模式的分子基础;解析了真菌非还原型聚酮合酶结构域的相互作用规律,并发现了硫酯酶结构域对最终聚酮产物结构的决定作用;通过重新组合不同间苯酚大环内酯的生物合成途径和互换结构域,在酿酒酵母中实现了真菌系列新型聚酮类化合物的一步合成。这些研究结果不仅为揭示天然聚酮类化合物的程序化生物合成机制奠定了理论基础,而且也为缩短目标代谢产物的发酵时间,提高产量,大规模实现真菌聚酮化合物的工程化组合生物合成提供了新的方法。(本文来源于《中国化学会第十一届全国天然有机化学学术会议论文集（第一册）》期刊2016-09-25）
徐玉泉[7]（2016）在《利用成像质谱和组合生物合成发现和创制新型活性化合物》一文中研究指出微生物合成的次级代谢产物在农业和医药生产中发挥着重要作用,但"难以发现、合成效率低和不易于结构改造"是研制新型生物活性化合物的瓶颈。采用已有的技术手段难以发现微生物合成的微量但具有重要活性的次级代谢产物,无法原位研究这些代谢物的作用机制。微生物成像质谱不仅可以直接观察到微生物产生的微量重要次级代谢产物在培养基中的时空分布,而且还可以同时原位研究多个代谢物在微生物之间的相互作用。不仅为发现新型抗生素提供了良好的技术平台,而且也为全面解析抗生素的生物合成和作用机制创造了条件,加速了新型抗生素的研制进程。天然抗生素一般要经过结构改造才能提高药效,但天然产物含有较多立体异构和取代基等复杂的化学结构,利用化学合成和修饰非常困难,因此,利用微生物代谢途径的多样性,通过不同合成模块的重新组合,是实现复杂手性化合物结构改进和药效提高的有效措施。通过重新组合不同真菌聚酮化合物的生物合成模块,能够实现活性提高的系列新型真菌聚酮化合物的一步合成。这些研究不仅为揭示天然聚酮类化合物的程序化生物合成机制奠定了重要理论基础,而且也为大规模实现新型真菌聚酮类抗生素的工程化生物合成提供了创新的方法。(本文来源于《中国菌物学会2016年学术年会论文摘要集》期刊2016-08-19）
王珊珊[8]（2015）在《β-胡萝卜素的组合生物合成》一文中研究指出酿洒酵母作为真核生物的模式生物,具有遗传信息清晰,发酵条件成熟等特点。类胡萝卜素是具有抗氧化、抗癌等多种生理功能的高附加值四萜类化合物。本文以不同来源的合成β-胡萝卜素的基因为基础,在酿酒酵母中利用不同的方法构建高效的β-胡萝卜素的生物合成途径,并对其发酵条件进行优化。具体工作如下：1、分别对不同的重组菌InvSC 1-1 (pYES2-carRA-carB/pRS42-ggps-idi)、InvSC 1-2 (pYES2-carRA-carBlpRS425-ggps)及InvSC 1-3(pYES2-carRA-carB-ggps)进行发酵,发酵产β-胡萝卜素的产量分别为1.495 mg·L-1、2.053 mg·L-1、2.137 mg·L-1。分别采用不同碳源对InvSC1-3进行发酵,当碳源为1%葡萄糖+2%半乳糖时,β-胡萝卜素的产量最高,为3.188mg·L-1。分别选用不同效应物添加到培养基中,对InvSC1-1进行发酵。当异烟肼浓度为0.8 g·L-1时,单位菌体中β-胡萝卜素产量提高了4.57倍,为164.56μg·g-1；酮康唑浓度为10 mg·L-1时,单位菌体中β-胡萝卜素产量提高了2.74倍,为98.77gg·g-1。2、以质粒PACCAR16ΔcrtX为模板,分别扩增米自欧文氏菌的合成类胡萝卜素的基因crtI、crtY、crtB、crtE,在酿酒酵母中构建β-胡萝卜素的生物合成途径。并将其与来自叁孢布拉氏霉中具有相同功能的酶基因在不同酿洒酵母(InvSC1、BY4741)中产β-胡萝卜素的能力进行比较。确定不同来源的基因在InvSC1中产β-胡萝卜素的能力较强。3、分别过量表达β-胡萝卜素合成途径中涉及的单个酶或两个酶基因,进而筛选出限速酶基因,最终确定carB为其中的限速酶基因,过量表达carB后,β-胡萝卜素的产量提高了1.22倍,为40.13 mg·L-1。4、利用2A体系在酿酒酵母中构建不同来源的p-胡萝卜素的生物合成途径pYES2-crtY-crtI-crtB-crtE及pYES2-carRA-carB-ggps,β-胡萝卜素的产量分别为16.5 1mg·L-1及24.50 mg·L-1。(本文来源于《北京化工大学》期刊2015-05-27）
唐亮[9]（2015）在《叁条谷胱甘肽生物合成途径在酿酒酵母中组合表达的研究》一文中研究指出谷胱甘肽(Glutathione, GSH)是一种广泛存在于生物体内的生物活性叁肽化合物。半胱氨酸残基上的巯基使其在生物体内发挥重要的生理功能,如抗氧化、解毒和免疫调控等。GSH已经被广泛应用于医药、食品和化妆品等行业。在大多数生物体内,GSH主要由y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gsh1)和谷胱甘肽合成酶(Gsh2)两个酶依次催化合成；在一些致病性革兰氏阳性细菌中,存在一种双功能的合成酶(GshF)可单独催化GSH的合成；此外,在Gsh1缺陷的细胞中发现了一条GSH合成的替代途径,通过参与脯氨酸生物合成的第一个功能蛋白酶γ-谷氨酰激酶(GK)的功能来实现对Gsh1的替代作用。随着对GSH生物合成和代谢过程的深入研究,利用基因工程手段构建GSH高产菌株,然后进行工业发酵是GSH生产的最有效手段,关于Gshl/Gsh2或GshF在宿主细胞中单独高表达的研究有很多。本研究希望提供一个新的技术方法,即将目前发现的叁条GSH合成途径在宿主细胞中进行组合表达,进一步增强工程菌GSH的合成能力,为工业化生产提供新的技术方案。主要研究结果如下：一、γ-谷氨酰激酶参与的GSH合成途径的确证和GSH的合成通过敲除酿酒酵母内源的gshl基因,同时替换为酿酒酵母和大肠杆菌的γ-谷氨酰激酶编码基因,然后比较获得的重组菌株对过氧化氢的耐受性,发现高表达酿酒酵母自身的γ-谷氨酰激酶(Pro1)可增强Gshl缺陷的菌株对过氧化氢的耐受性；在酿酒酵母W303-1b中高表达γ-谷氨酰激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白(Pro1-GshB),获得的重组菌株W303-1b/P的GSH合成能力得到一定程度的提升。结果表明高表达Pro1可以通过积累Y-谷氨酰磷酸进而合成GSH。二、叁条GSH生物合成途径的组合表达和GSH的合成在酿酒酵母W303-1b中高表达谷胱甘肽合成酶-连接肽-γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶融合蛋白(Gsh2-Gsh1),获得重组菌株W303-1b/G,与工程菌W303-1 b/P和实验室前期构建重组菌株W303-1b/F(高表达双功能酶GshF)一起代表高表达单途径工程菌,对叁条GSH合成途径进行组合表达,获得重组双途径组合工程菌W303-1b/FG、W303-1b/FP和叁途径组合工程菌W303-1b/FGP。摇瓶发酵结果表明W303-1b/F在单途径工程菌中GSH产量最高,为187 mg/L,单位OD值的产量为2.45 mg/L/OD,组合新的途径可进一步提高GSH产量,叁途径组合菌株W303-lb/FGP的产量最高,为217 mg/L,单位OD值GSH产量为2.78 mg/L/OD;前体氨基酸添加实验结果进一步证实了叁个途径组合的优势,表现出更强的前体氨基酸转化能力,通过添加前体,W303-lb/FGP的GSH产量提高61.37%,而单途径菌株W303-1b/F的GSH产量仅提高43.17%。叁、10L发酵罐放大培养对叁途径工程菌W303-1b/FGP进行了10L发酵罐放大培养,为菌株的高密度发酵做初步探索。结果表明,工程菌在放大培养中稳定性较好,通过利用发酵罐控制发酵参数,与摇瓶相比发酵周期明显缩短,发酵24 h后GSH产量达273 mg/L,单位OD值的产量为2.7 mg/L/OD,通过补糖可进一步实现生物量与产量的提升。综上所述,叁途径组合方法进一步提高了工程菌GSH的合成能力,叁途径工程菌打破了单途径工程菌产量的瓶颈,其在GSH工业生产上具有很大潜力,为进一步工业化生产菌株的优化提供技术借鉴。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2015-05-01）
黄传龙,谭树华,顾觉奋[10]（2014）在《新技术在聚酮组合生物合成中的应用研究进展》一文中研究指出本文综述了生物信息学软件、光交联技术、异源表达以及底盘细胞在聚酮组合生物合成中的应用。并尝试将其整合为一粗略的开发思路,即"计算机虚拟设计→高通量技术筛选→(底盘细胞作宿主)异源表达"。希望通过引入新技术,能进一步提高聚酮组合生物合成的开发效率。(本文来源于《国外医药(抗生素分册)》期刊2014年06期）
组合生物合成论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
微生物中构建植物源天然产物的生物合成面临着许多挑战,尤其是当需要表达与激活植物源细胞色素P450酶的时候。通过从几种细菌中筛选HpaB和HpaC两种酶,本文在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中构建了具有活性的4-羟基苯乙酸-3-羟化酶(4HPA3H),它可以发挥植物源细胞色素P450酶的相似作用,用于生产咖啡酸。在与一个共同的酪氨酸氨裂合酶(TAL)协同作用下,不同的异源HpaB酶和HpaC酶组合在将底物L-酪氨酸转化为目标产物咖啡酸上展现出不同能力。以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的HpaB酶和肠沙门氏菌(Salmonella enterica)的HpaC酶的异源酶组合可生产最高咖啡酸产量,摇瓶培养下可达到(289.4±4.6)mg·L–1。酵母底盘细胞与异源酶的相容性得到了有效的改善,咖啡酸的产量比初始值提高了40倍。铜绿假单胞菌HpaB酶中黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合域周围的6个关键氨基酸残基与其他细菌来源的HpaB酶有明显区别,可能在影响酶活性方面起关键作用。综上,我们建立了一种有效的方法来构建高效的酵母系统用于合成非天然羟基苯丙烷类化合物。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
组合生物合成论文参考文献
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