首页> 正文

GH12家族糖苷水解酶Cel12A的功能研究

2020-12-09阅读(393)

GH12家族糖苷水解酶Cel12A的功能研究

论文摘要

纤维素是地球上含量最多的可再生性资源,其天然结构稳定,在自然环境下降解缓慢。目前利用纤维素酶对纤维素资源进行酶法转化是人们研究的热点。本实验室前期从Bacillus licheniformis ATCC 14580菌株中克隆了GH12家族酶基因cel12A,并对其进行了初步的异源表达及酶学性质研究。本论文以此为基础,一方面对Cel12A的内切纤维素酶功能进行研究,通过序列比对和突变体构建确定了对酶活性具有重要作用的氨基酸位点,并对其可能的作用机制进行了深入研究。另一方面以Cel12A为对象,利用电子显微镜观察及协同作用实验等探讨了小分子量的GH12家族酶可能存在的非水解膨胀功能。本文的主要实验结果如下:(1)通过序列比对确定了GH12家族纤维素酶中可能与酶功能相关的15个保守氨基酸,对这些位点进行了丙氨酸筛选,突变体酶活性的测定结果显示这些氨基酸对Cel12A的活性具有不同程度的影响。亲核基团E155和酸碱催化基团E243突变后,重组酶活性完全丧失;D137突变后重组酶几乎丧失全部酶活性,暗示D137可能作为“催化三联体”的第三个成员发挥作用;此外N51A、W53A、Y89A及N133A突变体比酶活失活近80%,M157A与W159A突变体比酶活失活近70%,V86A与W139A突变体比酶活失活近60%,P167A与F245A突变体比酶活失活近30%,V199A和I189A突变体比酶活失活低于20%。(2)进一步对影响酶活性程度较大的N51、W53、Y89和N133四个位点的功能进行研究。对N51进行天冬氨酸D和丙氨酸A方向的突变,突变后酶的剩余活性均不足30%,显示出N51可能通过与底物结合形成氢键而发挥作用。对W53进行酪氨酸Y和组氨酸H方向的突变,突变后酶的剩余活性均不足30%,说明W53可能在GH12家族酶分子与底物识别与结合过程中发挥重要的作用。对Y89进行苯丙氨酸F方向突变,突变后酶基本维持原来的活性,推测在酶催化底物过程中Y89的作用是维持糖环正确的构象。对N133进行天冬氨酸D、苯丙氨酸F方向的突变,结果显示突变体后的酶活性呈梯度下降,表明N133与酸碱催化基团之间所形成的氢键是Cel12A识别与催化纤维素类底物的结构基础,同时,N133突变体最适pH向酸性方向偏转了近0.4个单位,暗示该位点能够影响催化残基的催化环境,进而对酶活性的维持及催化断键时的最适pH产生影响。(3)扫描电子显微镜观察到经Cel12A预处理的不溶性纤维素底物明显变得蓬松;同时也检测到Cel12A与商品化纤维素酶在与这些底物的作用过程中具有协同作用。这些实验结果表明Cel12A作为小分子量蛋白发挥了类似于植物ExPansin及Swollenin的膨胀功能。(4)为进一步探究Cel12A发挥膨胀功能的原因,以内切纤维素酶活性完全丧失的Cel12A失活突变体为材料进行了膨胀实验。结果显示,Cel12A失活突变体也能一定程度地发挥膨胀功能,但与野生型相比,膨胀功能有所下降,说明Cel12A具有膨胀功能的原因可能与其内切纤维素酶的活性及小分子蛋白的特性均具有相关性。本论文探讨了Cel12A的分子作用机制及非酶因子膨胀功能,为GH12家族纤维素酶的蛋白质工程改造及体外高效复合酶系的构建提供了理论和实验信息。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 前言
  •   1.1. 纤维素
  •   1.2. 纤维素的生物降解
  •     1.2.1. 纤维素酶
  •     1.2.2. 纤维素降解中的非酶因子
  •   1.3. 纤维素酶的分子改造
  •     1.3.1. 以定点突变为代表的纤维素酶定点理性设计
  •     1.3.2. 纤维素酶的定向进化
  •     1.3.3. 基于结构生物信息学的纤维素酶结构理性设计
  •   1.4. 立题依据及主要研究内容
  • 第二章 糖苷水解酶Cel12A内切纤维素酶功能的研究
  •   2.1. 实验材料
  •     2.1.1. 实验菌株与质粒
  •     2.1.2. 实验试剂
  •     2.1.3. 实验仪器
  •     2.1.4. 培养基和缓冲液
  •   2.2. 实验方法
  •     2.2.1. 序列分析
  •     2.2.2. 重组质粒的构建
  •     2.2.3. 突变体的构建
  •     2.2.4. 重组蛋白的表达
  •     2.2.5. 重组蛋白的分离纯化
  •     2.2.6. 重组蛋白的SDS-PAGE电泳检测
  •     2.2.7. 重组蛋白的蛋白浓度检测
  •     2.2.8. 重组蛋白的酶活性测定
  •     2.2.9. 重组蛋白的底物特异性测定
  •   2.3. 实验结果与讨论
  •     2.3.1. 重组蛋白Cel12A的构建及性质研究
  •     2.3.2. Cel12A保守氨基酸的丙氨酸筛选
  •     2.3.3. Cel12A关键氨基酸的功能分析
  •   2.4. 小结
  • 第三章 糖苷水解酶Cel12A膨胀功能的研究
  •   3.1. 实验材料
  •     3.1.1. 实验用酶
  •     3.1.2. 实验试剂
  •     3.1.3. 实验仪器
  •   3.2. 实验方法
  •     3.2.1. 重组蛋白处理纤维素底物的扫描电镜观察
  •     3.2.2. 重组蛋白与纤维素酶对纤维素底物的协同降解作用
  •   3.3. 实验结果与讨论
  •     3.3.1. Cel12A的膨胀功能
  •     3.3.2. Cel12A失活突变体的膨胀功能
  •     3.3.3. Cel12A与失活突变体膨胀功能的比较
  •   3.4. 小结
  • 结论及展望
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 杨宇萌

    导师: 陈珊

    关键词: 纤维素酶,家族,功能分析,定点突变,诱导表达

    来源: 东北师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 东北师范大学

    分类号: Q55

    总页数: 83

    文件大小: 6783K

    下载量: 47

    相关论文文献

    • [1].产纤维素酶混合菌发酵优化及秸秆降解研究[J]. 饲料研究 2020(06)
    • [2].外切纤维素酶的研究与应用进展[J]. 生物技术进展 2020(05)
    • [3].纤维素酶基因的研究进展[J]. 山东畜牧兽医 2019(02)
    • [4].高产纤维素酶真菌的筛选及鉴定[J]. 食品与发酵工业 2019(06)
    • [5].棉针织物抛光整理纤维素酶自动输出模型的建立[J]. 染整技术 2019(02)
    • [6].微生物中纤维素酶的研究进展[J]. 曲阜师范大学学报(自然科学版) 2019(04)
    • [7].持续性内切纤维素酶高效催化的研究进展[J]. 微生物学杂志 2019(05)
    • [8].纤维素酶在畜牧生产中的应用[J]. 饲料广角 2017(12)
    • [9].纤维素酶研究现状及其在畜牧业中的应用[J]. 今日畜牧兽医 2018(05)
    • [10].纤维素酶在畜牧养殖中的应用研究进展[J]. 饲料广角 2018(07)
    • [11].纤维素酶的研究现状及其在畜牧生产中的应用[J]. 当代畜禽养殖业 2018(10)
    • [12].细菌产生的纤维素酶(综述)(续1)[J]. 国外畜牧学(猪与禽) 2018(11)
    • [13].一株产纤维素酶的黄曲霉发酵条件初步研究[J]. 科技风 2017(17)
    • [14].碱性体系下修饰纤维素酶米氏常数的测定[J]. 当代化工 2016(08)
    • [15].纤维素酶高产菌种选育及酶活测定[J]. 生物产业技术 2008(02)
    • [16].纤维素酶分子改造和酶系改造[J]. 生物产业技术 2008(03)
    • [17].纤维素酶生产技术的研究进展[J]. 生物产业技术 2014(03)
    • [18].青霉纤维素酶基因的表达调控与重组表达研究进展[J]. 广西科学 2015(01)
    • [19].产纤维素酶黑曲霉菌的研究进展[J]. 畜牧与兽医 2015(06)
    • [20].2017年普通高等学校招生全国统一考试(江苏卷)——生物[J]. 中学生物学 2017(07)
    • [21].实验巧设计 结果重分析[J]. 求学 2017(09)
    • [22].温度对水果酵素发酵性能的影响[J]. 中国食品学报 2020(02)
    • [23].酒糟中纤维素酶产生菌的筛选及酶学特性研究[J]. 内蒙古农业大学学报(自然科学版) 2020(01)
    • [24].产纤维素酶细菌的分离、鉴定与酶学性质研究[J]. 广东药科大学学报 2019(01)
    • [25].产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展[J]. 科技资讯 2019(18)
    • [26].纤维素酶在奶牛生产上的应用[J]. 畜牧与饲料科学 2017(12)
    • [27].高效低成本纤维素酶诱导物的制备、筛选及应用[J]. 基因组学与应用生物学 2017(06)
    • [28].白蚁内源性纤维素酶基因资源研究进展[J]. 生物技术通报 2015(12)
    • [29].一株米曲霉产纤维素酶条件的优化[J]. 现代农业科技 2016(08)
    • [30].海洋细菌Bacillus sp.HN07的分离鉴定及所产碱性纤维素酶性质研究[J]. 工业微生物 2009(04)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  

    GH12家族糖苷水解酶Cel12A的功能研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6