江筱荷[1]2014年在《肝癌基因差异表达谱的筛选及EIF3B对肝癌细胞增殖的影响》文中进行了进一步梳理研究背景与目的：肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界第二大癌症致死的主要疾病，其中有一半的肝癌诊断和死亡发生在我国。研究证实肝癌的发生、发展是多步骤的，很多异常表达的基因在影响肝细胞恶性转化的过程中起了关键作用，这些基因参与细胞生命进程的各个关键环节，如细胞周期的控制，细胞生长、凋亡及细胞的迁移和扩散。针对肝癌的发生发展，筛选鉴定与肝细胞恶性转化密切相关的分子靶标将可能为临床上肝癌患者开发潜在的治疗靶点。近几年，cDNA微阵列（基因芯片）技术的出现及发展，为在全基因组内寻找与肿瘤等疾病发生、发展相关的差异性表达的基因提供了一个强有力的手段。在本研究中，我们将使用Affymetrix公司的Human Geome U133plus2.0基因表达谱芯片在人类全基因组范围内检测、比较肝癌患者肿瘤组织及癌旁正常肝组织基因表达谱的差异，获得二者的差异表达基因，利用生物信息学的初步挖掘，筛选出有关的功能基因作为潜在的分子靶标，从而获得更多与肝癌发生转化相关的分子机制的生物学信息。本实验旨在全基因组范围内筛选肝细胞癌的相关致病基因，初步研究目的基因对肝癌细胞的增殖、凋亡的影响，开发肝癌潜在的治疗靶点。第一章利用基因芯片技术筛选肝癌组织中的差异表达基因研究目的：通过Affmetrix基因表达谱芯片技术研究肝癌组织与癌旁正常肝组织之间的基因差异表达谱，筛选出进一步研究的致病基因。方法：收集2013年5月至2013年12月期间在南昌大学第二附属医院肝胆外科进行肝癌手术并经病理学检查证实的原发性肝癌病人的组织标本，建立了肝癌标本库，并按标准流程进行标本的采集、处理、保存等。本研究经过南昌大学第二附属医院伦理委员会批准，并通过受试对象的知情同意。在肝癌标本库中随机选取了手术切除的肝癌组织及癌旁正常肝组织共10对采用Affmetrix基因表达谱芯片进行分析：提取总RNA，质量检定基本合格后，对RNA进行荧光标记，芯片杂交，清洗，用GeneChip Scanner3000扫描仪扫描芯片，得到杂交芯片的图像资料，用GeneChip Operating software (GCOS)图像分析软件对扫描得到的原始图像进行分析处理，得到芯片上两种样本各点的杂交信号强度值以及其信号强度比值。比值大于或等于2时，我们认为两样本之间是有显着差异的。结果：总RNA质检结果：10组样品总RNA的质量可靠，可入选用于下一步的芯片杂交实验。经cDNA微阵列基因芯片初步筛选，结果由SAM软件分析处理，得到肝癌组织和癌旁正常组织的差异表达基因：相对癌旁正常肝组织，在肝癌组织中共有93个基因表达显着上调；68个基因表达明显下调。结论：1、肝癌与正常肝组织之间存在明显差异表达的mRNA，这些差异表达的基因可能在肝癌的发生发展中发挥重要作用，可能成为新的肝癌分子标记物或潜在的治疗靶点。2、EIF3B过表达与肝癌的发生发展相关。第二章EIF3B抑制肝癌SMMC-7721细胞株增殖的研究研究目的：通过一系列的体外细胞功能实验，研究EIF3B对肝癌细胞增殖的作用，以便进一步了解EIF3B在肝癌中的生物学功能。方法：找吉凯基因公司构建EIF3B的干扰RNA，利用慢病毒包装转染至肝癌SMMC-7721细胞株。实验分为两组：1、阴性对照组（Negative Control），为正常目的细胞、加阴性对照病毒感染的细胞组；2、EIF3B-siRNA组，为正常目的细胞、加EIF3B-siRNA慢病毒感染的细胞组。应用细胞计数、平板克隆形成实验观察EIF3B下调对肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响，通过流式细胞术分析EIF3B下调对肝癌SMMC-7721细胞周期的影响。结果：1、细胞计数结果显示：EIF3B-siRNA组与对照组比，活细胞数目明显减少（P<0.05），增殖能力受到抑制；2、平板克隆形成实验结果显示：EIF3B-siRNA组与对照组相比，细胞克隆形成数目显着减少（P<0.01），说明EIF3B表达促进了肝癌SMMC-7721细胞的增殖；3、流式细胞术结果显示：转染EIF3B-siRNA后肝癌细胞G0／G1期减少，S期G2／M期增多，说明出现细胞周期进展，肿瘤细胞增殖增多。结论：1、下调EIF3B可抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖。2、EIF3B可能影响细胞周期相关的通路促进肝癌细胞增殖。
余桂华[2]2004年在《不同侵袭性肝癌基因差异表达的初步研究》文中指出目 的 研究不同侵袭性肝癌组织间基因表达的差异方 法 先选取荧光锚定引物和随机引物各1条,对荧光差异显示方法进行摸索,再以高侵袭性肝癌组织与低侵袭性肝癌组织互为对照,采用mRNA差异显示法,筛选出差异表达片段,利用斑点杂交技术鉴定真假阳性结果,对真阳性片段克隆测序,通过登录Genbank基因库进行同源性分析。应用免疫组织化学技术对45例肝癌组织进行该差异基因表达的检测。结 果 筛选出3条差异显示片段(S1-3), 杂交鉴定只有S2为真阳性克隆, 与Genbank基因库中人类基质金属蛋白酶-1(MMP1)基因高度同源。在45例肝癌组织中,应用免疫组织化学分析显示,高侵袭组MMP-1表达明显高于低侵袭组(P<0.01),而低侵袭组的癌组织与癌旁非癌组织相比表达并无差异(P>0.05)。结 论 肝细胞癌中MMP-1表达升高与肿瘤细胞侵袭转移能力的增强有关。
殷静[3]2014年在《肝积方对肝郁脾虚因素协同DEN诱导大鼠实验性肝癌基因表达的干预及临床疗效观察》文中研究表明研究目的：探讨具有疏肝健脾、活血化瘀功效的肝积方干预肝郁脾虚因素协同二乙基亚硝胺(DEN)诱导的实验性肝癌的分子靶点,从基因差异表达层次阐明肝积方作用的机理；并通过小样本临床研究初步评估其对患者肝郁脾虚症状及相关生化指标的影响,为病-证-方药对应的肝积方复方在基因表达层次的干预机制研究提供有益的探索。研究方法：1.肝积方对肝郁脾虚因素协同DEN诱导实验性肝癌基因表达的干预健康雄性Wistar大鼠18只随机随机分为DEN诱发实验性肝癌模型组、DEN迭加肝郁脾虚因素诱癌组、DEN迭加肝郁脾虚因素诱癌并肝积方干预组共3组,每组6只。正常喂养3周后开始建模,DEN6mg/ml灌胃,每周1次,中药肝积方隔天给药,1.5ml/只,第7周末开始时停用诱癌剂DEN,分别刺激共8周后处死大鼠。分离大鼠肝脏组织并提取分离待检测组织的总RNA各3ug,采用RATREF-12Expression Bead芯片,其包含12种不用品系的大鼠全基因组系列,共有22526支探针,含有21910个基因,完成基因芯片的靶标制备、杂交、清洗、染色及扫描,芯片扫描完成后采用昂飞基因芯片操作软件版本1.4对扫描信号进行分析、转化、提取及芯片间比较,以Ratio值大于2或者小于0.5倍标准筛选差异表达基因。然后参照晶芯⑧博奥生物分子功能注释系统3.0(MAS3.0)中的G0(Gene Ontology)数据库对差异表达基因的细胞组成、生物过程及分子功能进行标准化注释,对差异表达基因进行功能分类,最后结合肝郁脾虚型肝癌发病的病理生理学、病因病机及肝积方的作用机制回归临床,筛选有意义基因进行分析。从基因差异表达层次阐明肝积方干预肝郁脾虚因素协同DEN诱导实验性肝癌的分子靶点。2.肝积方对肝郁脾虚型肝癌患者临床疗效观察入组广州中医药大学第一附属医院门诊及住院部2013年6月至2014年3月肝郁脾虚型原发性肝癌的患者共30例,采用简单的自身前后对照研究方法,给予中药肝积方汤剂,口服,日一剂,共14±2天,治疗前后评价临床症状积分、KPS评分、肝功能分级(Child-Pugh)、外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)、血清5羟色胺含量、唾液淀粉酶活性变化,通过上述指标综合评价肝积方的疗效。研究结果：1.肝积方对肝郁脾虚因素协同DEN诱导实验性肝癌基因表达的干预1.1大鼠一般状况随着造模时间的推移,实验开始第5周即造模开始后第2周,各组大鼠皮毛逐渐失去光泽,活动减少,喜静,饮食减少,体重增加,少数大鼠出现大便变稀溏、次数增多的改变,第6周开始至第8周结束期间,与单纯诱癌组相比,DEN迭加肝郁脾虚因素诱癌组、DEN迭加肝郁脾虚因素诱癌并肝积方干预组大鼠体重逐渐减轻,单纯诱癌组大鼠体重继续增加,但干预组大鼠在精神、饮食、大便、活动方面较DEN迭加肝郁脾虚因素诱癌组相比,上述症状稍轻、体重减轻较慢。1.2肝积方对肝郁脾虚因素协同DEN诱导实验性肝癌模型相关基因表达谱的影响利用基因芯片检测出肝积方干预肝郁脾虚因素协同DEN诱导实验性肝癌大鼠模型的差异表达基因((ratio值大于2或者小于0.5)共有54个,其中15个基因上调,39个基因下调,如下表1、表2所示：表2肝积方干预肝郁脾虚因素协同DEN诱导肝癌下调基因Rn.3990Prkd30.483Rn.147523Nmnat10.484Rn.118530Mup50.484Rn.7429Oasl0.485Rn.53932Gramd30.486Rn.198318G1p20.487Rn.91524RGD15635330.488Rn.10211Lss0.488Rn.11041Chp0.488Rn.81140Thrsp0.488Rn.2334Uqcrc20.489Rn.2789Slc31al0.490Rn.95841Ddx3x0.491Rn.2042Rhob0.491Rn.121213Eif4g20.491Rn.2113Id10.492Rn.144829Hspa410.492Rn.2178Ghr0.496Rn.161972Azi20.497Rn.34914Mapk10.498Rn.203174Torlaip20.4502.肝积方对肝郁脾虚型肝癌患者临床疗效观察2.1患者一般情况观察的合格的肝郁脾虚型肝癌患者共30例,平均年龄为55.2岁；临床诊断为原发性肝癌的有12例,占总病例数的40%：经穿刺病理诊断为原发性肝癌的有18例,占总病例数的60%,其中肝细胞癌16例；胆管细胞癌2例。2.2症状积分变化及免疫学指标、肝功能、5-HT、唾液淀粉酶活性指标评价(1)治疗前、后患者体力状况及临床症状积分变化比较：①治疗后患者KPS评分较前轻微升高,但无显着意义(P>0.05)；②临床症状总积分比较：总体上看,治疗后患者的临床症状、体征改善明显(P<0.05),临床症状改善有效率为73.3%；③治疗前、后肝郁脾虚型肝癌患者临床症状的比较：治疗后患者胁肋胀痛、情绪抑郁、纳呆、消瘦乏力的症状得到显着改善(P<0.05),治疗对患者暖气、痞块、腹胀、大便溏泄、舌脉无明显改善作用(P>0.05)。(2)治疗前、后外周血T淋巴细胞亚群比较：①治疗后患者外周血CD8+T明显降低(P<0.05)；②随着病情进展,治疗后患者外周血CD3+T细胞总数、CD4+T细胞比治疗前均继续降低(P<0.05)；③与治疗前相比,患者CD4+/CD8+比值较前升高,差异有显着性(P<0.05)。(3)治疗前、后肝功能(Child-Push评分)比较：经肝积方治疗后患者肝功能评分变化不大,差异无统计学意义(P>0.05)。(4)治疗前、后血清5-HT比较：经肝积方治疗后患者血清5-HT含量有轻微升高,但无显着差异(P>0.05)。(5)治疗前、后唾液淀粉酶活性比较：经检测患者酸刺激前后唾液淀粉酶活性比值发现,治疗前30例入组患者中共有23例患者酸刺激前后唾液淀粉酶活性比值小于1,为脾虚证表现,经肝积方中药治疗后,30例患者中有24名患者酸刺激前后唾液淀粉酶活性比值大于1,表明患者脾虚证明显改善,经统计学检验有显着的意义(P<0.05)。研究结论：实验研究表明：利用基因芯片检测出肝积方干预肝郁脾虚因素协同DEN诱导实验性肝癌大鼠模型的的差异表达基因共有54个,其中15个基因上调,39个基因下调,以上基因中涉及物质转运的有Abcg5、Cdh17、Slc31al等,涉及信号转导的有Tfrc、Ghr、Cav2,参与蛋白辅助的有dh4、Mx2、Mapk1等,与基因表达调控相关的有Pspcl、Ddx27、Sox6等,参与物质代谢的有Hmgcr、Adh4、Acat2等；与血管生长因子相关的有Cav2、Egrl；与炎性反应相关的有Usp18、Sox6、Egr1等；与离子通道相关的基因有Fus、Chp、Uqcrc2、与细胞骨架结构相关的有RGD1565416、Vcl、Rhob等；与内分泌神经机制相关的有Usp18、Sv2b、Hspa41;与免疫相关的基因有Mx2、Hspa41、Uspl8；另外还有部分基因目前功能尚未知。通过对常见的差异表达基因Mx2、Egr1、Hspa41、Mapk1、Sox6、Cdh17基因进行功能阐述,结合肝郁脾虚型肝癌发病的病理生理学及病因病机回归临床进行分析,结果提示肝积方可能主要通过介导物质代谢、免疫机制相关、炎性反应、神经内分泌机制、血管生长因子相关等途径在肝郁、脾虚、血瘀叁个主要方面通过多个基因的综合调节发挥其整体干预效应。临床研究表明：肝积方能明显改善肝郁脾虚型肝癌患者的主要临床症状,并通过改善患者主要临床症状提高患者生存质量；同时肝积方在一定程度上可以改善肝癌患者的细胞免疫功能低下的状态,对患者肝功能有一定的稳定作用；另外肝积方可以改善患者唾液淀粉酶活性,稳定患者血清5-HT水平。
阚学峰[4]2004年在《肝癌相关基因差异表达的初步研究》文中进行了进一步梳理肝癌的发生和发展是多基因参与、多阶段进行的复杂过程，要了解其发生、发展和浸润转移的分子机制，综合分析肿瘤发生过程中大量基因的表达变化是十分必要的。 目的：对获得的肝癌相关差异表达基因进行生物信息学分析，利用RT-PCR技术研究AFP、COL1A2、UBD、FN、Genimin、GPC3、SPINT2、Stathmin、VEGFB和IGFBP3等10个基因在肝癌组织和癌旁组织间的差异表达情况，及与临床病理学特征的关系；依据10个基因差异表达情况对肝癌分子切缘进行初步研究；建立多重RT-PCR检测基因表达的方法。 方法：收集肝癌手术标本并保存于-80℃；挑选125个差异表达基因阳性克隆进行测序和生物信息学分析；提取手术标本的mRNA后利用RT-PCR对10个肝癌相关基因的差异表达进行半定量分析，多重RT-PCR扩增实验。 结果：(1)125个克隆测序后经生物信息学分析获得基因83个，其中细胞分裂相关基因5个，参与细胞信号转导或通讯的基因5个，参与细胞结构或运动的基因7个，细胞或器官防御相关基因11个，参与细胞内基因转录或蛋白表达的基因22个，代谢相关基因18个，另有15个未归类基因。(2)10个基因在50例患者癌内和癌旁组织中的表达结果表明它们在癌和癌旁组织之间存在差异表达，除去癌内低表达基因IGFBP3以外，其余9个基因在癌和癌旁组织间的差异表达具有显着性差异。(3)SPINT2在癌和癌旁组织间的差异表达和肿瘤大小有关，COL1A2的差异表达和血清AFP水平及肿瘤组织学分级有关，FN和AFP基因的差异表达都和血清AFP异常相关；10个基因的差异表达均和是否携带乙型肝炎表面抗原无关。(4)对25例患者距手术切缘2cm、1cm肝组织、癌旁组织和癌组织的检测表明，10个基因的表达呈现递减(癌高表达基因)或递增(癌低表达基因IGFBP3)的趋势。(5)建立了多重RT-PCR检测基因表达的方法。 结论：(1)125个克隆测序后经分析获得83个肝癌相关高表达基因。(2)天津医科大学硕士学位论文中文摘要AFP等9个肝癌相关高表达基因在癌内和癌旁组织之间存在显着的差异性表达。(3)AFP等10个基因在癌周组织内的表达呈现递减(癌高表达基因)或递增(癌低表达基因IeFBP3)的趋势。(4)AFP、eoLzAZ、sPINTZ、FN等4个基因和肿瘤大小、组织学分级、血清AFP等因素有关。(5)10个基因差异表达提示肝癌组织周围存在分子切缘。(6)成功建立了多重RT一PCR检测基因表达的方法。
查斌山[5]2009年在《SPP-1、GDF-15和CXCL-1在人小肝癌中表达的初步研究》文中指出肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种严重危害人类健康的疾病。我国肝癌的病死率占恶性肿瘤病死率第二位,占全球肝癌死亡人数的53%,且发病率和死亡率呈逐渐上升趋势,发病年龄构成也渐趋年轻化,加大力度进行肝癌的深入研究具有紧迫和重要的意义。临床实践证明,早期肝癌(临床小肝癌)预后优于中晚期肝癌,二者术后3年和5年生存率存在显着性差异。因而早发现和早治疗成为肝癌研究的重点。肝癌的早期诊断率仍亟待提高。目前认为血清AFP(alpha-fetoprotein,甲胎球蛋白)为较可靠的肝癌血清学标志物,其敏感性为60%～70%,特异性为90%左右,但约18%的肝癌AFP不升高。早期肝癌AFP的假阴性率更可高达40%。因而,单凭AFP诊断肝癌易造成漏诊与误诊。寻找新的有助早期诊断的肿瘤血清标志物一直是备受关注的研究热点。有报告显示,血清DCP(des-gamma carboxyprothrombin,脱-γ-羧基凝血酶原)、AFP-L3(AFP异质体)、Glypican-3(磷脂酰肌醇)等有助于提高肝癌诊断的敏感性和特异性,并可以发现部分AFP阴性的小肝癌。但迄今研究结果还远不能满足临床诊断和治疗需求。因此,寻找更敏感、特异的与AFP有互补诊断价值并具有治疗开发价值的肝癌早期分子标志物,建立肝癌早期相关血清蛋白谱系显得十分迫切。课题组前期利用生物信息学方法对大鼠肝癌基因芯片结果进行聚类和分析,筛选出了14个肝癌早期差异表达编码分泌蛋白基因。在此基础上,本研究剔除了文献已经报道的,选择文献尚未报道与早期肝癌相关的3个分子:分泌性磷蛋白1(secreted phosphoperotein 1,SPP-1)、生长分化因子15(growth differentiation factor 15,GDF-15)和细胞趋化因子配体1(chemokine(c-x-c motif)ligand-1,CXCL-1),分别采用荧光定量PCR(polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)及双抗体夹心法ELISA(enzyme linked immunosorbent assay,酶联免疫吸附测定)对其在人小肝癌与正常对照组mRNA水平和血清蛋白水平的表达进行了鉴定,初步预测其在小肝癌诊断中的价值。研究方法:1、利用生物信息学方法分析处理Rat Expression Array 230 2.0大鼠肝癌基因芯片结果;2、应用实时定量PCR方法检测15例小肝癌及正常肝脏组织(癌旁正常肝脏组织)的mRNA水平;3、双抗体夹心法ELISA技术检测对应小肝癌患者血清和正常人血清中的血清蛋白表达水平。结果:1、对基因芯片结果进行初步分析和二次分析,共筛选出14个人同源编码分泌蛋白基因;SPP-1、GDF-15和CXCL-1基因是上述筛选的候选标记物基因中的叁个文献尚未报道与早期肝癌相关的基因。探针号分别为:1367581_at、1377163_at、1387316_at;差异度分别为:2.9、3.8、2.2;2、荧光定量PCR提示:SPP-1、GDF-15和CXCL-1基因在小肝癌组织中较对照组表达显着上调,其差异有统计学意义(P<0.05);3、双抗体夹心法ELISA显示:SPP-1血清蛋白检测值与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);GDF-15血清蛋白含量在小肝癌组中表达水平明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05);小肝癌组中CXCL-1血清蛋白含量较正常对照组表达下调,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1、NF-κB信号通路基因(CXCL-1)、P53信号通路基因(GDF-15)和SPP-1基因在人小肝癌组织中高表达,提示这些基因可能与肝癌发生的早期过程相关;2、分泌性蛋白GDF-15和CXCL-1显示出小肝癌筛选诊断的潜在价值;3、以动物模型为线索,利用基因芯片技术结合合理的生物信息学分析是筛选肿瘤基因差异表达的有效方法,具有可行性和可靠性。
谷军生[6]2016年在《miR-144靶向细胞周期蛋白B1抑制肝癌增殖、迁移和侵袭的初步研究》文中提出研究背景:全球预计有20亿人目前或曾经感染过乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV),约2.4亿人是慢性HBV表面抗原携带者。预计全球每年有65万人死于慢性乙肝并发症,约13万人死于急性肝炎。整体上,HBV感染占据了大约45%的肝癌病例,占据约30%的肝硬化病例。肝癌在男性人群死亡的原因中排名前叁,尤其是东南亚地区。根据肝脏肿瘤的病理表现和分子特征,肝脏肿瘤主要分为以下叁种:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、肝胆管型肝癌(cholangiocarcinoma,CCA)、恶性血管内皮细胞瘤(malignant angioendothelioma)。其中最常见的是肝细胞肝癌,肝细胞肝癌的发病率在全世界恶性肿瘤中居第五位,在所有肝脏肿瘤所占比例中高达90%。肝癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势,是危害人类健康的重大疾病。肝细胞肝癌手术后发生转移和复发的比例非常高,所以导致肝癌患者总体临床预后较差。肝细胞肝癌的发病机制目前尚未完全明确,针对肝癌的靶向治疗手段依然缺乏。对于肝细胞肝癌患者,肝癌根治性切除术是早期肝癌的主要治疗手段,但是5年内仍会有超过50%的肝癌患者术后发生转移和复发。近年来国际上靶向肝癌的最有效的靶向治疗药物—索拉非尼(sorafenib)给肝癌领域带来新的希望,但是其治疗效果差强人意,同时它们除了对癌细胞起作用外也对正常细胞产生副作用,所以目前肝癌的治疗仍然面临巨大的挑战。随着科学技术的发展以及二代测序技术的兴起,对肝癌基因和蛋白分子水平的深入研究结果表明:很多基因和蛋白与肝癌的分期、复发和转移的恶性特征密切相关,而这些基因和蛋白在肝细胞肝癌的形成和进展过程中发挥了重要的功能,有可能成为未来肝癌精准治疗基因或蛋白的分子靶点。因此,研究肝癌细胞增殖和肝癌转移的分子机制,找到能够在早期准确预测肝癌发生、转移和预后的诊断标志物,采取及时有效的预防和治疗措施,对肝细胞肝癌患者的综合治疗有着重要的意义。细胞周期蛋白B1(cyclin B1,CCNB1)是一种细胞结构蛋白,是成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)的伴侣分子。CCNB1的含量在整个细胞周期中呈周期性变化,主要出现在S期开始表达,晚期在细胞质中合成,在G1期表达量达到顶峰,在细胞核膜破裂之前CCDB1被输入到核内,在G2/M时达到峰值,然后迅速被泛素化降解(Ubation),到有丝分裂中期向后期转换时消失。在M中期,MPF活性达到最高,CCNB1和泛素结合后会立即被蛋白酶体(proteasome)识别并胞内降解,从而导致成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)失活,细胞周期M期结束。正常细胞内存在许多细胞周期调控相关蛋白,以维持其基因组完整性和稳定性。但细胞周期调控失衡,会导致肿瘤基因表达异常,继而导致肿瘤细胞增殖及凋亡调控失衡,导致肿瘤的发生。细胞周期蛋白B1是一些原癌基因的产物,因此CCNB1蛋白有可能成为肿瘤潜在的新的治疗靶点,但是CCNB1和肝癌的相关研究目前较少。目前研究已经证实CCNBl在许多肿瘤组织中表达异常。CCNBl通常是过表达的且异常定位于细胞质而非胞核:有研究发现抑制CCNBl向胞质的转运可以诱导凋亡,同时证实细胞周期蛋白B1的表达失衡和肿瘤细胞的形成和发展关系十分密切,并且大量研究证实CCNB1具有的抗凋亡作用机制在肿瘤形成发展过程中也起到了重要作用。大量研究已经证实CCNBl高表达和非小细胞肺癌、食道鳞癌等多种肿瘤的临床预后密切相关;还有学者利用基因微阵列技术发现通过检测CCNB1基因在肿瘤组织中的表达水平可以预测肿瘤的恶性临床表型(转移、复发,化疗耐药性、生存预后),可以为临床的诊断和治疗提供预测的功能。深入的机制研究发现:CCNB1在肿瘤细胞和组织中的异常表达可以导致成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)磷酸化调节机制失衡,所以通过下调CCNBl的表达继而抑制MPF的功能,能够阻止或者干扰肿瘤细胞越过G/M检验点进行细胞分裂增殖,可能是一种潜在的靶向治疗肿瘤的方法。靶向CCNB1也成为靶向肿瘤治疗的一个富有前景的方向。目前直接靶向CCNBl的临床研究还处于起步研究和探索阶段,依然存在很多问题,例如抗CCNBl药物的肿瘤组织靶向问题及其毒副作用,所以通过寻找CCNBl信号转导通路调节通路上关键的基因或者蛋白,对CCNBl信号转导通路调控通路进行更深入的研究,寻找新型的肿瘤治疗靶点,是肿瘤治疗的潜在方向,所以通过靶向CCNBl信号转导通路可能成为抗肿瘤研究领域中具有临床应用前景的方向。micro RNA(即miRNA)是内源性非编码的小RNA的一种,人类基因组内含有的micro RNA就有上千个,每一个micro RNA可以直接调控的靶基因约两百个,而且人体中有将近33%的蛋白编码基因都会受到micro RNA的控制,通过这些数据可以发现,micro RNA在人类基因表达中有着非常重要的地位。近年研究发现约50%已知的miRNAs与多种人类肿瘤相关,表明其在肿瘤发生中具有重要作用。从已证实功能的miRNA来看,它们实际上可作为致癌基因或抑癌基因而发挥作用,同时Micro RNA分子在转录后水平对于基因的调控是现在研究的热点之一。近年来对相关micro RNAs的研究结果提示miRNA在肝细胞肝癌的疾病发生发展过程中发挥了至关重要的调节作用。大量研究证实micro RNAs通过其特有的调节机制,参与了肝癌形成、发展,以及肝癌细胞的分化、增殖凋亡、侵袭和转移等几乎所有的重要生理过程。而大量的大样本测序数据实验结果表明miRNA在肝癌组织或者血清中的表达差异与肝癌恶性临床表型(转移、复发,化疗耐药性、生存预后)密切相关。micro RNA在肝癌的临床诊治和预后中都有着显着作用,但就目前的研究情况来看,关于micro RNA的表达水平研究较多,关于核苷酸序列是否会发生突变的研究较少,核苷酸序列的变化会对micro RNA的功能造成影响,有可能会诱发肝癌,因此应注重对micro RNA序列中碱基突变情况的检测。除此之外,目前的研究中主要关注micro RNA对mRNA的调控,而忽视了micro RNA自身表达可能会受到哪些调控。在肝癌的诊断方面,由于有较多的micro RNA表达会发生变化,可以作为诊断肝癌的micro RNA较多,需要在大样本中验证micro RNA的特异性和敏感度,从而选择准确率和稳定性都较高的micro RNA作为诊断标准,准确指导预后,也是未来需要重点研究的对象以上这些研究结果说明miRNA不仅仅能够为肝细胞肝癌的早期诊断及检测提供新型的临床标志物,miRNA还可以作为判断肝细胞肝癌临床恶性表型及预后的工具。所以进一步深入研究在肝癌发生进展中起着重要作用的miRNA以及其深入的调控机制,能够为肝癌的精准治疗提供新的靶点和方向。近年来关于miRNA和肝癌进展的相关研究表明:miR-122是肝脏特异表达的miRNA,在正常肝脏表达丰富,miR-122在HCC组织低表达,可以靶向cyclin G1、Bcl-2等基因,有研究发现其可以促进丙型肝炎病毒(HCV)的复制。除此之外,大量研究也证实miR-101、miR-34a、miR-224、miR-222等在肝癌异常表达的miRNA在肝癌的发生发展过程中发挥了重要作用。以上这些结果提示miRNA在肝癌疾病进展中起到了重要的作用,micro RNA是HCC调控的重要环节之一。micro RNA能够参与肝癌细胞的分化、增殖以及凋亡等环节,对肝癌的发生和发展有着较为密切的关系,所以对于micro RNA与肝癌之间的关系也是目前诸多研究学者重点关注的问题。基于以上研究背景:本研究首先利用TCGA和GEO公共数据库的大样本肝癌表达谱数据分析发现肝癌组织中CCNB1表达水平呈异常升高,并且发现CCNB1的异常表达和肝癌临床恶性表型密切相关,并且CCNB1高表达是影响肝癌患者总体生存预后的独立危险因素,Kaplan-Meier分析结果显示CCNB1低表达的肝癌患者的生存时间明显好于CCNB1高表达的患者,提示CCNB1的表达和肝癌患者的临床预后密切相关。同时进一步的细胞功能试验证实:敲减CCNB1基因后肝癌细胞的增殖能力明显降低,迁移能力和侵袭能力以及成瘤能力明显降低,CCNB1基因敲减后肝癌细胞系的凋亡率明显升高,提示CCNB1在肝癌的发生发展中起到了重要的作用,但是其异常表达的机制尚不明确。为了研究CCNB1在肝癌中异常高表达的分子机制,我们首先通过生物信息学手段筛选鉴定出能够靶向抑制CCNB1的miR-144,并且我们通过RT-PCR、Westernblot证实在肝癌细胞中,miR-144能够靶向抑制CCNB1的表达。随后的分析我们发现miR-144的表达水平在肝癌组织中显着降低,miR-144低表达的肝癌患者的生存时间明显差于miR-144高表达的患者,提示miR-144的表达和肝癌患者的临床预后密切相关,miR-144可能是抑癌基因。并且我们在肝癌细胞中过表达miR-144后,肝癌细胞系的增殖能力明显下降,与CCNB1基因敲除有着相似的效果,提示miR-144/CCNB1调节轴在肝癌的发生和发展中可能起到了重要的作用。同时进一步,我们利用裸鼠皮下成瘤实验在体内进一步验证miR-144-CCNB1调节轴的体内作用,为miR-144-CCNB1调节轴成为肝癌潜在靶向治疗靶点提供更加充分的证据,我们首先构建miR-144过表达慢病毒载体,进一步采用祼鼠荷瘤实验观察miR-144过表达对肝癌细胞体内转移能力的影响。研究结果表明:和转染空病毒的裸鼠组相比,过表达miR-144后裸鼠皮下肝癌增殖速度明显减慢,裸鼠生存时间明显增加。同时经过免疫组化证实过表达miR-144后CCNB1表达降低,Ki67降低,说明肝癌中miR-144能够靶向负向调节CCNB1的表达,继而影响肿瘤增殖速度。通过以上叁部分的实验,我们得出以下结论:1,CCNB1在肝癌中表达明显升高,并和患者转移、复发率等临床恶性表型和临床预后密切相关,CCNB1在肝癌的发生和发展过程中起到促癌基因作用;2,miR-144在肝癌中能够特异性的结合CCNB1的3’UTR区,靶向调控CCNB1的表达。3,miR-144在肝癌中表达明显降低,同时miR-144低表达患者的生存时间明显短于miR-144的表达高的患者;过表达后,在体内外实验中,肝癌细胞系的增殖能力显着降低,迁移能力和侵袭能力以及成瘤能力明显降低,提示miR-144在肝癌的发生和发展过程中起到抑癌基因作用,miR-144通过负性调节其靶基因CCNB1的蛋白表达,从而促进肝癌进展。4,miR-144/CCNB1调节轴在肝癌的发生发展中起到了重要作用,有可能成为肝癌治疗的新靶点。第一部分CCNB1在肝癌中的表达和临床预后的分析及其在肝癌中的生物学功能目的:研究CCNB1在肝癌组织中的表达和临床特征及预后的关系,探讨CCNB1在肝癌增殖侵袭转移中的调节作用及其分子机制。方法:1.应用Western Blot方法检测8对肝癌和对应癌旁组织CCNB1蛋白在肝癌组织中的表达情况。2.基于生物信息学技术,利用基因芯片分析软件BRB-Arraytools进行肝癌基因表达谱挖掘,下载并分析TCGA和GEO公共数据库中的肝癌基因芯片数据,分析CCNB1 mRNA在肝癌组织与正常肝癌中的表达情况。3.利用TCGA公共数据库中的肝癌基因芯片数据,结合其临床随访数据,分析CCNB1 mRNA在肝癌组织中的表达和肝癌临床表型之间的关系。4.从mRNA和蛋白水平综合分析CCNB1表达强度与患者临床特征及预后之间的联系。5.基于组织芯片技术检测CCNB1蛋白在肝癌组织中的表达强度,通过单因素和多因素COX回归、以及生存分析等手段分析CCNB1蛋白表达强度与肝癌患者临床特征及预后之间的关系。6.利用RNA干扰技术沉默CCNB1基因,将靶向CCNB1的siRNA转染至肝癌细胞系HepG2和7721,检测研究其对肝癌细胞的生长(MTT)、凋亡(流式Annexin V染色法)、迁移(划痕实验)和侵袭(transwell)的生物学行为的影响。结果:1.肝癌组织中的表达:与正常肝组织对比,在mRNA(TCGA和GEO基因数据库分析)和水平蛋白(肝癌组织芯片),肝癌组织中CCNB1表达水平均有一定程度的上调(P﹤0.05)。2.根据CCNB1的表达水平,我们进行了单因素分析,从统计分析结果中我们可以看出,肝癌组织中CCNB1低表达占40%,高表达占60%,CCNB1的表达与TNM分期(P=0.038)、转移(P=0.000)、复发(P=0.030)有关,而与性别(P=0.573)、年龄(P=0.461)、肿瘤直径(P=0.057)、AFP(P=0.665)、HBs Ag(P=0.897)无明显相关。3.其次我们根据患者的预后进行了单因素分析,从统计分析结果中我们可以看出,肝癌患者的预后与TNM分期(P=0.006)、转移(P=0.000)、复发(P=0.041)以及CCNB1的表达有关(P=0.001),而与性别(P=0.430)、年龄(P=0.086)、肿瘤直径(P=0.118)、AFP(P=0.740)、HBs Ag(P=0.897)无明显相关。。4.根据肝癌组织芯片的分析结果我们发现,Kaplan-Meier分析结果显示CCNB1的表达水平与肝癌患者的预后密切相关,单因素分析结果显示CCNB1的表达与肝癌临床恶性表型(转移、复发、TNM分期及预后)密切相关。5.CCNB1基因敲减后肝癌细胞系的增殖能力明显降低,细胞迁移能力和侵袭能力以及成瘤能力受到显着的抑制;CCNB1基因敲减后肝癌细胞系的凋亡率明显升高。第二部分靶向CCNB1基因的miR144的筛选与鉴定及其对肝癌细胞生物学行为的影响目的:利用生物信息学技术对能够靶向CCNB1基因的micro RNA进行筛选和鉴定,并且在体外验证此micro RNA对肝癌生物学行为的影响方法:1.通过在线预测工具(Targetscan,miRwalk,miRanda)筛选出能够靶向CCNB1的miRNAs的集合,然后利用TCGA数据库中的425例肝癌样本的micro RNA表达谱进行分析,然后从中寻找出在肝癌和癌旁中表达存在显着性差异,且在肝癌中低表达的miRNAs,筛选出潜在的可能靶向CCNB1的miR-144。2.在肝癌细胞中过表达或抑制miR-144后,检测CCNB1 mRNA和蛋白表达水平变化。3.利用荧光素酶报告试验验证对miR-144对CCNB1的负性靶向调控作用。4.分析TCGA数据中micro RNA芯片表达谱数据,结合其随访数据,分析miR-144在肝癌组织中的表达和肝癌临床表型之间的关系。5.在肝癌细胞中过表达或抑制miR-144后,观察肝癌细胞的增殖能力变化。结果:1.生物信息学分析结果提示CCNB1可能是miR-144的靶基因。通过荧光素酶报告实验证实miR-144可以抑制含有CCNB1结合位点的萤光报告基因的活性。进一步的实验证实过表达或抑制miR-144对CCNB1表达水平有明显影响。2.miR-144的表达水平在肝癌组织中显着降低(p<0.0001),并且Kaplan-Meier分析结果显示miR-144的表达水平和肝癌患者的临床预后显着相关(p=0.017),miR-144低表达的肝癌患者的生存时间明显差于于miR-144高表达的患者,提示miR-144的表达和肝癌患者的临床预后密切相关。3.miR-144过表达后,肝癌细胞系的增殖能力明显下降,与CCNB1敲除有相似的效果。从而证实了miR-144通过转录后水平负性调控CCNB1参与肝癌的侵袭和转移。第叁部分miR-144对肝癌细胞生物学行为影响的裸鼠体内研究目的:通过构建miR-144稳定过表达的肝癌细胞系,并皮下注射入裸鼠体内成瘤,观察miR-144对肝癌细胞生物学行为影响。方法:1.利用慢病毒技术构建过表达miR-144的肝癌7721细胞系。2.构建miR-144过表达慢病毒载体,将miR-144过表达载体感染肝癌细胞以上调miR-144表达,将这种过表达miR-144的肝癌细胞注入裸鼠皮下,在体内观察miR-144对肝癌生物学行为的影响。3.观察并记录裸鼠生存时间,记录肿瘤体积和重量变化,并绘制肿瘤生长曲线。结果:1.经RT-PCR和Westernblot鉴定,过表达miR-144的肝癌7721细胞系构建成功。2.体内实验证实,和转染空病毒的裸鼠组相比,过表达miR-144后肝癌增殖速度明显减慢,生存时间明显增加。3.免疫组化证实过表达miR-144后CCNB1表达降低,Ki67降低。全文结论1.CCNB1在肝癌中表达明显升高,并和患者转移、复发率等临床恶性表型密切相关,同时CCNB1低表达患者的生存时间明显高于CCNB1的表达高的患者;下调CCNB1后,肝癌的增殖能力显着下降,凋亡率明显升高,迁移和侵袭能力以及成瘤能力明显下降提示CCNB1在肝癌的发生和发展过程中起到促癌基因作用。2.过表达或抑制miR-144对CCNB1水平有明显影响,提示miR-144在肝癌中能够靶向调控CCNB1的表达。3.miR-144在肝癌中表达明显降低,同时miR-144低表达患者的生存时间明显短于miR-144的表达高的患者;过表达后,肝癌在体内外的增殖能力军显着下降,迁移和侵袭能力以及成瘤能力明显下降。提示miR-144在肝癌的发生和发展过程中起到抑癌基因作用。4.miR-144通过负性调节其靶基因CCNB1的蛋白表达,从而促进肝癌进展,miR-144/CCNB1调节轴在肝癌的发生发展中起到了重要作用,有可能成为肝癌治疗的新靶点。
何国珍[7]2012年在《广西肝癌高发区肝癌高危人群预警标志物的初步筛选》文中研究表明广西是我国肝癌发生率和死亡率都较高的省份之一,肝癌发病急剧,就诊发现的肝癌往往处于中晚期,临床预后极差。因此,寻找肝癌发生、发展标志物,建立广西肝癌高发区高危人群发生肝癌危险性的预测体系是肝癌防治的重要措施。肝癌的形成是一个多因素、多机制、多基因协同作用的长期复杂过程,是多个基因表达水平改变导致细胞内出现异常分子变化的结果,所以,至今尚未发现较好的肿瘤标志物在高危人群筛检中成为肝癌的预警生物标志物。肿瘤标志物可分为基因标志物和基因表型标志物,以往研究大多为单因素研究模式,一般集中在一个或数个基因和蛋白质,无法全面了解整个基因组多个基因的变化,也不能同时了解多个体液蛋白质的变化,因此,不能全面反映肝癌的分子生物学特征。本研究采用基于广西肝癌高发现场高危人群队列的病例对照研究方法,应用基因芯片技术和蛋白质芯片技术在基因转录水平和蛋白质水平上进行初步筛选,不仅可阐明该地区肝癌发生发展的可能分子生物学机制,同时也为寻找特异性和敏感度都较高的肝癌高危人群预警生物标志物提供依据,同时,也可以阐明该地区肝癌发生发展的分子生物学机制。本研究分以下四个部分进行。第一部分广西肝癌高发区肝癌相关差异表达基因的初步筛选目的:检测广西肝癌高发区肝癌患者和同地区匹配正常人群外周血基因表达谱的差异,对差异表达基因进行分类汇总,通过生物信息学分析,从中挑选候选基因。方法1研究对象:从广西肝癌高发区高危人群队列中选择肝癌病例9例,按照1:1的比例配比,选择同一地区匹配的正常人群9例作为对照组。所有研究对象在知情同意情况下进行问卷调查和采血,采血时未进行手术、放化疗以及生物治疗。2研究方法:采集EDTA抗凝血5ml,提取两组标本的总RNA并纯化mRNA,逆转录合成荧光标记的cDNA探针,与罗氏人表达谱芯片进行杂交,筛选出两组外周血标本的差异表达基因。最后通过Gene Ontology、KEGG和NCBI等数据库分析差异表达基因分子功能、生物过程、细胞组分以及生物学通路,并查阅大量的文献报道,挑选候选基因。结果1肝癌组与对照组外周血之间的基因表达谱存在差异。2在9例肝癌患者外周血中表达情况一致,且与对照组外周血基因表达相比有明显差异的基因有42条,占基因总数的0.93‰,其中上调的基因有20条:上调倍数最大的是GOS2基因,上调倍数为7倍;IGHA1基因上调的倍数为4倍,有两个未知基因的上调倍数在3-4倍,MXD1、IL1R、SLC22A4叁个基因的上调倍数在3倍,其余基因的上调倍数都在2倍。下调大于2倍的基因有22条。根据基因参与的生物学过程不同,将这些差异表达基因进行大致分类,发现在上调基因中:与细胞增殖有关的上调基因有 MXD1、IL1R2、IGHAI、TOB1、PROK2 等基因;DUSP1、GOS2、IL8和JUNB、PROK2等基因与细胞周期有关;JUNB与生殖相关;STK17B与凋亡相关;与物质代谢和转运有关的基因有SLC22A4和IRS2; NFIL3和ASGR2与信号传导和转录有关;有LRG1、SLC22A和FLJ36031等3条基因功能不明。下调基因KLRFI、KLRC1和XCL1等基因与信号转导有关;PRF1、GAMA、GAMH和GZMB与免疫应答有关;HOP与细胞分化有关;EDG8、KSP37等5条下调基因的功能不明。3经生物信息学分析,42条差异表达基因涉及到生殖、发育过程、细胞增殖与分化、代谢、生物节律、信号转导、血液循环、血管生成、细胞凋亡、免疫应答、细胞周期、氧化应激、细胞迁移等生物学过程。上调基因的生物学通路多参与细胞增殖、细胞凋亡和细胞因子通路,下调基因多与免疫应答等通路有关。4上调的20条基因中,有3条未知基因,其余17条基因中有12条基因被报道与恶性肿瘤的发生有关。5.对12条与恶性肿瘤发生有关的上调基因再次筛选,结合文献报道,选择PROK2和DUSP1基因作为下一步实验的候选基因。结论:使用基因芯片技术可以一次性、平行的比较不同研究对象外周血的基因表达谱差异。借助这一技术,本研究发现了42条与广西肝癌高发区肝癌发生发展有关的基因,大多数基因与细胞周期调控和信号转导有关,另外尚有部分功能未明的基因。结果提示该地区肝癌的发生发展可能是在环境因素作用下出现多个基因mRNA表达水平改变的结果。对这些差异表达基因进行系统研究将有助于阐明广西肝癌高发区肝癌发生发展的可能机制,寻找和发现高危人群的可能预警生物标志物。第二部分差异表达基因PROK2和DUSP1在广西肝癌高发区肝癌患者外周血中的表达验证目的:从基因芯片结果中挑选出差异基因PROK2和DUSP1,增大各组样本的例数,比较PROK2和DUSP1基因在肝癌组和正常匹配人群外周血中的mRNA表达情况,以验证基因芯片结果的可靠性,并初步探讨这些基因与广西肝癌高发区肝癌之间的关系。方法1研究对象:从广西肝癌高发区高危人群队列中选取肝癌病例25例,按照1:1的比例配比,选择同一地区的匹配正常人25例作为对照组。所有研究对象在采血时未进行手术、放化疗以及生物治疗,并在知情同意情况下进行问卷调查和采血。2研究方法:采集EDTA抗凝血5ml,提取两组标本的总RNA,逆转录为cDNA后,应用荧光定量RT-PCR中的相对定量法检测PROK2和DUSP1基因在两组标本外周血中的mRNA表达情况。将这些基因的表达情况与高发区肝癌患者的流行病学资料结合分析,初步探讨PROK2和DUSP1基因与广西肝癌高发区肝细胞癌之间的关系。结果:肝癌患者外周血PROK2的mRNA表达水平为7.21 ±2.39,对照组PROK2的mRNA表达水平为1.24±0.44,统计学分析两组的PROK2的mRNA表达水平有显着性差异(P<0.01);肝癌患者外周血DUSP1的mRNA表达水平为2.48±0.93,对照组DUSP1的mRNA表达水平为0.83±0.327,统计学分析两组的DUSP1的mRNA表达水平有显着性差异(P<0.01)结论1肝癌组外周血PROK2和DUSP1基因表达上调,说明PROK2和DUSP1基因与广西肝癌高发区肝癌的发生发展相关。2 PROK2基因和DUSP1基因在肝癌的形成过程中发挥了一定的作用,且两个基因均与MAPK信号通路有关,其相互的作用机理有待于进一步研究。3 PROK2基因和DUSP1基因在肝癌组外周血中的表达水平显着升高,有望进入肝癌高发区肝癌预警标志物的进一步筛选研究。4肝癌的发生发展是个复杂的病理过程,其间有大量的基因发生了改变,这些基因之间又可能存在着或多或少的联系,采用以广西肝癌高发现场高危人群队列为基础的病例对照研究方法,对这些基因进行系统研究将有助于阐明该地区肝癌发生机制和寻找高危人群可能的预警生物标志物。5在扩大样本例数以后,荧光定量RT-PCR的研究结果与芯片研究结果基本一致,提示基因芯片是一种可行的研究技术,其研究结果具备一定的可重复性。第叁部分广西肝癌高发区肝癌相关差异蛋白的初步筛选目的:检测广西肝癌高发区肝癌患者和同地区匹配正常人群血清生长因子和凋亡因子的差异。方法1研究对象:从广西肝癌高发区高危人群队列中选择肝癌病例11例,按照1:1的比例配比,选择同一地区匹配正常人11例作为对照组。所有研究对象在知情同意情况下进行问卷调查和采血,采血时未进行手术、放化疗以及生物治疗。2研究方法:采集非抗凝血5ml,离心分离血清,稀释后与蛋白质芯片杂交,用激光扫描仪扫描并收集信号图像进行数据分析,筛选出两组标本血清的差异蛋白质。结果:肝癌患者血清IGFBP-2浓度为887.48±225.91pg/ml,对照组血清IGFBP-2浓度为558.17± 125.97pg/ml,两组标本血清IGFBP-2浓度有统计学意义(P<0.05);肝癌患者血清P21相对定量水平为1040.97±395.91,对照组血清P21水平为2756.64±1355.64,两组标本血清P21浓度有统计学意义(P<0.05)。结论1.广西肝癌高发区肝癌患者和同地区匹配正常人群的血清蛋白质存在差异。2.在肝癌患者血清中表达情况一致,且与对照组血清蛋白质相比有较明显差异的蛋白质有2条,分别为IGFBP-2和P21。这两种蛋白质调控细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡过程。3.应用蛋白质芯片技术可以一次性高通量筛选疾病相关蛋白质,我们将此技术用于肝癌高发区肝癌血清标志物的研究,检测到的差异蛋白质,可能与广西肝癌高发区肝癌发生发展相关。对这些蛋白质进行验证研究将为寻找肝癌高发区肝癌血清预警标志物提供线索和依据。第四部分差异蛋白IGFBP-2和P21在广西肝癌高发区肝癌患者血清中的验证目的:从蛋白质芯片结果中挑选出的在肝癌组和对照组血清中有差异的蛋白质IGFBP-2和P21,增大各组样本的例数,比较两组标本血清IGFBP-2和P21的浓度,以验证蛋白质芯片结果的可靠性,并初步探讨这些蛋白质与广西肝癌高发区肝癌之间的关系。方法1研究对象:从广西肝癌高发区高危人群队列中选择肝癌病例44例,按照1:1的比例配比,选择同一地区的高危人群44例作为对照组。所有研究对象在采血时未进行手术、放化疗以及生物治疗,并在知情同意情况下进行问卷调查和采血。2研究方法:采集非抗凝血5ml,离心分离血清后,应用ELISA方法检测两组研究对象血清IGFBP-2和P21的浓度,与高发区肝癌患者的流行病学资料结合分析,初步探讨IGFBP-2和P21与肝癌高发区肝癌的关系。结果:肝癌患者血清IGFBP-2浓度为2846.66±1834.74ng/L,对照组血清IGFBP-2浓度为1657.39±577.55 ng/L,两组标本血清IGFBP-2浓度有统计学意义(P<0.05);肝癌患者血清P21浓度为2925.81±1144.74ng/L,对照组血清P21浓度为7848.43±1834.74ng/L,两组标本血清P21浓度有统计学意义(P<0.05)。结论:在肝癌患者血清中,IGFBP-2的含量上升,而P21蛋白质含量下降,提示IGFBP-2和P21两种蛋白质可能参与了广西肝癌高发区肝癌发生发展过程,血清IGFBP-2和P21两种蛋白质可能成为肝癌高发区肝癌预警肿瘤标志物。在扩大样本例数以后,ELISA方法的研究结果与蛋白质芯片研究结果基本一致,提示蛋白质芯片是一种可行的研究技术,其研究结果具备一定的可重复性。
张媛媛[8]2007年在《旋毛虫抗Hepa1-6肿瘤效应的研究》文中指出本试验分别于荷瘤前11d及荷瘤后7d给C57BL/6小鼠接种未经处理的旋毛虫、Co60处理旋毛虫和紫外线处理旋毛虫;于免疫旋毛虫可溶性粗抗原和ES抗原后7d荷瘤,通过对肿瘤的体积、重量、抑瘤率和免疫指标的分析,观测旋毛虫虫体和旋毛虫抗原对体内Hepa1-6肝癌细胞是否有抑制作用。然后用ELISA方法初步确定旋毛虫抗原与Hepa1-6肝癌细胞之间是否存在相关抗原,最后通过SDS-PAGE、Western-blot进一步确定两者相关抗原分子量大小。试验结果表明:未经处理的旋毛虫抑制Hepa1-6肝癌细胞的效果优于Co60处理旋毛虫和紫外线处理旋毛虫(P<0.05);旋毛虫肌幼虫ES抗原和旋毛虫可溶性粗抗原都有较好的抑瘤效果(P<0.05);ELISA检测发现旋毛虫与Hepa1-6肝癌细胞间存在相关抗原,Western-blot结果显示:旋毛虫可溶性抗原与Hepa1-6肝癌细胞高免血清反应条带的相对分子量为26.0 kDa左右及130kDa,Hepa1-6肝癌抗原与旋毛虫高免血清反应条带的相对分子量为94.0kDa,35.0kDa和14.4kDa。
余俊[9]2011年在《荧光定量PCR检测肝癌相关基因表达并建立分子诊断指数》文中认为肝细胞癌(HCC)恶性度高,预后差,早期诊断可改善患者预后。血清AFP敏感性低,诊断肝癌易造成漏诊。随着分子生物学的飞速发展,越来越多的肝癌血清标志物被报道,单一肝癌血清标志物的敏感性和特异性很难突破AFP的水平。多肿瘤标志物联合诊断可以有效提高肝癌的诊断率。本实验室前期应用荧光定量PCR检测肝脏组织中16个肝癌相关基因表达,从中优选出6个肝癌高度相关基因并建立分子诊断指数,提高了肝癌诊断的敏感性及特异性。研究目的：筛选特异性好、表达水平高的肝细胞癌相关基因,进一步优化基因组合,建立肝癌分子诊断指数,验证其在肝癌诊断中的价值。研究方法：从本实验室建立的HCC高／低表达基因cDNA文库和国内外文献中筛选抑癌基因4个PRDM2、IGFBP3、DLC1、WWOX)和癌基因9个(GPC3、STMN、CCNA2、UBD、CD133、BIRC5、AFP、E2F1、GMNN),合计13个基因。选择60例手术切除组织标本,其中10例正常肝、10例肝硬化、40例癌和配对癌旁及手术切缘组织,提取总mRNA后逆转录cDNA。采用实时荧光定量聚合酶链反应(QRT-PCR)检测此13个基因在正常肝、肝硬化、肝癌组织中的表达,以管家基因G3PDH为对照,2-△△cT法计算肝癌相关基因相对表达量,各组织与正常肝组织相比,2-△△CT值相差3倍认为该基因在该组织中存在异常表达。最终从13个备选基因中挑选出与肝癌相关程度高且与正常肝、肝硬化组织表达差异大的基因,依据这些基因在组织中异常表达的个数建立分子诊断指数,用ROC曲线初步评估其在HCC诊断中的价值。研究结果：13个备选基因中荧光定量PCR扩增效果好的基因共有11个。在40例癌组织中,抑癌基因PRDM2、IGFBP3、DLC1分别有65.0%、75.0%、67.5%的标本表达小于3倍正常肝组织,癌基因GPC3、STMN、CCNA2、BIRC5、AFP分别有87.5%、77.5%、82.5%、85.0%、67.5%的标本表达大于3倍正常肝组织,并且与肝硬化组织表达差异显着(各基因表达量中位数之比,0.19 vs 0.57；0.09vs O.53; 0.12 vs 0.42; 191.08 vs 3.30; 9.96 vs 0.96; 20.03 vs 1.58; 13.21 vs 1.45;24.20 vs 0.83；均P<0.05)。而WWOX只有30.0%的标本呈3倍量下调,CD133只有10.0%的标本呈3倍量上调；UBD有90.0%的标本呈3倍量上调,但亦有70.0%的肝硬化标本呈3倍量上调,特异性差；最终选取PRDM2、IGFBP3、DLC1、GPC3、STMN、CCNA2、BIRC5、AFP此8个基因作为肝癌高度相关基因。依据各基因的荧光定量相对值做散点图,抑癌基因PRDM2、IGFBP3、DLC1从正常肝、肝硬化到癌组表达呈明显递减趋势,癌基因GPC3、STMN、CCNA2、BIRC5、AFP从正常肝、肝硬化到癌组表达呈明显递增趋势。以此8个基因建立分子诊断指数,其在肝硬化、手术切缘、癌旁2 cm、癌组中分别为2.2±1.5、3.0±1.6、2.9±1.5、6.3±1.2,癌组与肝硬化组、切缘组、癌旁2 cm组差异显着。以肝硬化组作为对照组,当分子诊断指数大于等于3.5诊断为肝癌时,ROC曲线的敏感性为100%,特异性为90%,准确度为98%,AUC为0.995。分别以癌旁2cm组、手术切缘组为对照组,当分子诊断指数大于等于4.5诊断为肝癌时,ROC曲线的敏感性均为90%,特异性分别为81%、79%,准确度分别为91%、90%,AUC分别为0.952、0.946。在40例癌标本中,诊断指数从4到8,如将诊断指数7、8列为高诊断指数组(共15例样本),6、5、4列为低诊断指数组(共25例样本),对两组采用log-rank检验进行生存分析并绘制Kaplan-Meier生存曲线,结果低诊断指数组比高诊断指数组生存曲线高、下降平缓,两条曲线差异具有统计学意义,P=0.04,提示低诊断指数组预后较好。研究结论：荧光定量PCR检测肝癌相关基因在正常肝、肝硬化、手术切缘、癌旁2 cm及癌组织中的相对表达量,结果表明GPC3等8个基因在癌组织与其他各组织之间表达存在明显差异(均P<0.05),并且在癌组织中各基因的表达量亦有差别,说明基因改变存在于肝癌中且与肿瘤生长特性相关。优选PRDM2、IGFBP3、DLC1、GPC3、STM、CCNA2、BIRC5、AFP基因成功建立了分子诊断指数,应用ROC曲线对40例肝癌标本和其它标本进行分析,结果显示分子诊断指数在肝癌诊断中具有较高的准确度,能有效的鉴别癌组织与良性肝脏组织(肝硬化组织、癌旁硬化组织及手术切缘组织)。进一步将分子诊断指数用于患者的预后评估,具有低诊断指数的患者生存时间较长、预后较好。本实验证实了分子诊断指数在肝癌诊断中的价值,为下一步在血清中建立诊断指数提供了方法学及依据,使分子诊断指数能更好的应用于临床。
蒋明东[10]2007年在《声学微泡联合超声靶向介导耐药基因ASON转染逆转肝癌MDR》文中研究说明引言肝癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。在我国,肝癌占恶性肿瘤死亡率的第一或第二位,全球每年新发病例约45%在我国大陆地区,发病年龄趋于年轻化。目前肝癌临床以综合治疗为主,但肝癌细胞多药耐药(multidrug resistance,MDR)严重限制了治疗的效果。有资料显示90%以上肝癌病人的死因与MDR有关,因此如何逆转肿瘤MDR,提高肝癌有效治疗是一个亟待解决的问题。肿瘤MDR理想的逆转方法应该具有高效、无毒和靶向性(能特异性地作用于肿瘤而对正常组织无损害)的特点,然而现在的研究与此标准差距尚远。因此进行肝癌MDR系列研究,探讨新的逆转手段成为提高肿瘤控制的关键,具有非常重要的现实意义和应用价值。本课题共分四部分进行实验研究。建立人肝癌MDR细胞模型和裸鼠皮下移植瘤模型,利用声学微泡联合超声靶向介导mdr1、mrp耐药基因的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASON)转染,探讨对人肝癌细胞和移植瘤MDR的逆转效应和机理,力求寻找一种低毒、高效和靶向的逆转肝癌MDR的新方法,为提高肝癌综合治疗效果,开展临床肝癌基因治疗和高剂量冲击化疗提供理论依据。本研究将分子生物学寡核苷酸反义技术和声学微泡并超声治疗技术结合,借助声学微泡并超声的空化效应,以促进基因在肿瘤细胞的高效和靶向转染及表达,提高对MDR的逆转效率,在策略和技术上是一种创新。第一部分肝癌MDR细胞模型建立和生物学特性研究第一节顺铂递增加量-间歇作用法建立QGY肝癌MDR细胞模型及生物学特性鉴定目的:建立人肝癌QGY多药耐药细胞模型并初步检测其耐药特性。方法:以人肝癌细胞株QGY为亲本细胞,选用化疗药物顺铂(cisplatin,CDDP),以低浓度递增加量-间歇作用法诱导细胞耐药。光镜、电镜观察新建细胞株组织形态学及超微结构特点。测定细胞倍增时间并绘制生长曲线、观察细胞克隆形成和流式细胞仪(Flow Cytometry,FCM)检测细胞周期分布,鉴定新建细胞生物学特性。四甲基偶氮唑盐( 3-4,5-dimethyIthiazol-z-yl-2,5-dipheny tretrazolium bromide , MTT )法测定细胞药物敏感性,免疫组化(immunohistochemistry assay)检测细胞耐药蛋白P-gp、MRP和LRP,凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果:历时15周多,成功建立MDR细胞株QGY/CDDP。QGY/CDDP在组织形态学及超微结构上与亲本细胞QGY无明显差别。一般生物学特性:MDR细胞的群体倍增时间较亲代细胞延长25小时多,克隆形成率明显低于亲本细胞,G0/G1期细胞比例增加,S期和G2/M期细胞比例下降,与亲本细胞QGY比较有显着性差异(P<0.05)。药敏检测显示:QGY/CDDP细胞对CDDP高度耐药,耐药指数(resistance index,RI)为10.35,对ADM(阿霉素)、5-Fu(5-氟脲嘧啶)和AsT(叁氧化二砷)也产生耐药性,RI分别为5.50、8.51和9.23。免疫组化结果为MRP染色阳性细胞率最高,为23.89%,P-gp染色阳性细胞率为13.26%;LRP、Bcl-2和Bax染色阳性细胞率与亲本细胞接近。结论:新建细胞株QGY/CDDP具有MDR特性,其耐药机制由MRP和P-gp介导,以MRP介导机制为主,LRP、Bcl-2/Bax可能不参与QGY/CDDP耐药性的形成。第二节X射线照射法建立HePG2肝癌MDR细胞模型及耐药性鉴定目的:建立人肝癌HepG2多药耐药细胞模型并初步检测其耐药特性。方法:以人肝癌细胞株HepG2为亲本细胞,给于6MV直线加速器X-射线照射,诱导细胞耐药。HepG2细胞受X射线累积量照射后,接种到含浓度0.4μg/ml阿霉素(adriamycin,ADM)培养基中培养,发现细胞良好稳定增殖生长,提示细胞对抗ADM的细胞毒作用,即将新建细胞株命名为HepG2/ADM。光镜、电镜观察新建细胞株组织形态学及超微结构特点。测定细胞贴壁率、细胞克隆形成率和FCM检测细胞周期分布观察HepG2/ADM生物学特性。MTT法检测HepG2/ADM细胞药物敏感性,免疫组化测定细胞耐药蛋白P-gp、MRP、LRP以及凋亡蛋白Bcl-2/Bax表达,FCM测定细胞Rh123摄入和外排能力,间接检测P-gp和MRP功能。结果:历时45天多,X-射线照射累积剂量为24GY,处理后细胞能在含0.4μg/mlADM培养基中生长,即成功建立MDR细胞株HepG2/ADM。HepG2/ADM组织形态学及超微结构与亲本细胞HepG2无明显差别。一般生物学特性:HepG2/ADM细胞贴壁率、克隆形成率明显降低,G0/G1期细胞比例增加,S期及G2/M期细胞比例减少,与亲本细胞比较有显着性差异(P<0.05)。药敏检测显示:HepG2/ADM细胞对ADM高度耐药,RI为30.31,同时对CDDP、5-Fu和AsT也产生了耐药性,RI分别为6.12、6.94和9.15。免疫组化染色可见P-gp阳性染色细胞率最高,为85.62%,MRP阳性染色细胞率为12.36%,LRP阳性染色细胞率与亲本细胞接近,Bcl-2与Bax阳性染色细胞率分别为27.35%、6.25%,Bcl-2/Bax比值增高,较亲本细胞HepG2有显着性差异(P<0.05)。结论:新建细胞株HepG2/ADM具有MDR特性,其耐药机制由P-gp、MRP介导和凋亡蛋白Bcl-2/Bax共同作用,以P-gp介导机制为主。第二部分声学微泡联合超声靶向介导耐药基因ASON转染逆转肝癌细胞MDR的效应和机制目的:初步讨论声学微泡联合超声靶向介导耐药基因ASON转染逆转QGY/CDDP、HepG2/ADM人肝癌细胞株MDR的效应和作用机制。方法:取对数生长期细胞,调整成单细胞悬液,分别给于mdr1-ASON+声学微泡+超声、mrp-ASON+声学微泡+超声实验处理,待细胞生长良好,进行各项指标检测:在QGY/CDDP细胞,MTT法测定细胞耐药性变化,细胞贴壁率测定、细胞周期分布检测(FCM)、细胞凋亡TUNNEL法测定,观察细胞接受实验处理后的生物学特性变化,RT-PCR检测mdr1、mrp基因的mRNA表达,Western-blot测定细胞P-gp、MRP蛋白表达,免疫组化测定细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达。在HepG2/ADM细胞,AO/EB荧光法测定细胞凋亡,其它检测方法与QGY/CDDP实验处理后细胞检测一致。结果:QGY/CDDP细胞对CDDP、ADM、5-FU和AsT四种药物的耐药性有一定下调,RI降低:mdr1-ASON处理中,与对照组比较无显着性差异(P>0.05);mrp-ASON处理中,与阴性对照组比较有显着性差异(P<0.05),与阳性对照组比较无显着性差异(P>0.05)。mdr1-ASON转染后,细胞周期分布、P-gp、MRP的相对表达量和凋亡蛋白阳性细胞百分率的变化均较小,但与对照组比较差异无显着性(P>0.05);在细胞贴壁率、凋亡细胞TUNNEL法测定结果和耐药基因mRNA的相对表达量有一定变化(P<0.05)。mrp-ASON转染后,细胞贴壁率、细胞周期分布、TUNNEL法测定凋亡细胞、耐药基因mRNA的相对表达和P-gp、MRP的相对表达六项指标均有一定变化,有显着性差异(P<0.05);凋亡蛋白免疫组化结果一项变化较小。HepG2/ADM细胞实验处理后,细胞药物敏感性、细胞贴壁率、细胞周期分布、凋亡细胞、耐药基因mRNA表达、耐药蛋白的相对表达量和凋亡蛋白阳性细胞百分率等共七项检测指标均显示细胞有一定的变化,且与对照组比较有显着性差异(P<0.05);同样可见mdr1-ASON处理中,细胞的指标变化大于mrp-ASON处理。结论:mdr1-ASON+声学微泡+超声照射与mrp-ASON+声学微泡+超声照射能够部分逆转QGY/CDDP、HepG2/ADM人肝癌细胞的MDR。声学微泡结合超声比阳离子脂质体结合超声有更好的转染基因ASON靶向介导作用,显示对肝癌细胞株MDR更强的逆转效应。在QGY/CDDP细胞,mrp-ASON转染逆转MDR的作用明显强于mdr1-ASON转染;在HepG2/ADM细胞,mdr1-ASON、mrp-ASON转染均有较强逆转肿瘤MDR的作用,mdr1-ASON转染的MDR逆转作用更强。第叁部分裸鼠肝癌MDR移植瘤模型的建立和生物学特性研究目的:建立人肝癌QGY/CDDP、HepG2/ADM多药耐药的裸鼠移植瘤模型并鉴定其耐药特性。方法:取对数生长期QGY/CDDP、HepG2/ADM细胞,调整为单细胞悬液,按实验分组,采用细胞悬液皮下直接注射法,将MDR肿瘤细胞接种在裸鼠皮下,观察肿瘤生长并记录。待皮下移植瘤生长到一定大小,各组随机取两只裸鼠处死,剥离移植瘤组织块,提取移植瘤细胞培养,待细胞处于对数生长期进行耐药性检测。光镜、电镜观察移植瘤细胞组织形态学和超微结构特点。进行移植瘤细胞倍增时间并绘制生长曲线和细胞克隆形成率测定,观察移植瘤细胞的生物学特性。MTT测定移植瘤细胞药物敏感性,FCM检测移植瘤细胞P-gp、MRP表达,Western-blot测定细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达。结果:QGY/CDDP、HepG2/ADM荷瘤裸鼠的平均生存期为40±15d,移植瘤生长体积统计分析结果:两株细胞移植瘤生长均较其对应非耐药移植瘤细胞慢,有显着性差异(P<0.05)。MDR移植瘤细胞的组织形态学及超微结构与对应非耐药移植瘤细胞无明显差异。移植瘤细胞的生物学特性检测:两株细胞均呈现细胞倍增时间延长(P<0.05),细胞克隆形成率降低(P<0.05)。MTT法结果:两株MDR移植瘤细胞均对ADM、CDDP、5-FU和AsT四种药物耐药,QGY/CDDP移植瘤细胞对CDDP的RI最高,HepG2/ADM细胞对ADM的RI最高,与各自非耐药移植瘤细胞比较差异具有显着性差异(P<0.05)。耐药蛋白与凋亡蛋白测定结果:在QGY/CDDP移植瘤细胞,MRP蛋白染色阳性细胞率最高,为23.85%(P<0.05),P-gp染色阳性细胞率为7.44%(P<0.05);Bcl-2和Bax的相对表达与移植瘤QGY细胞接近(P>0.05)。在HepG2/ADM移植瘤细胞,P-gp蛋白染色阳性细胞率最高,为84.97%,MRP染色阳性细胞率为10.26%,Bcl-2和Bax的相对表达与移植瘤HepG2细胞比较有显着性差异(P<0.05)。结论:成功建立人肝癌QGY/CDDP、HepG2/ADM裸鼠皮下移植瘤模型。其耐药机制可能主要与mdr1及蛋白P-gp、mrp及蛋白MRP(P190)和凋亡蛋白Bcl-2/bax的表达有关。本移植瘤模型成功率高,可重复性强,生物学特性稳定。第四部分声学微泡联合超声靶向介导耐药基因ASON转染逆转裸鼠肝癌移植瘤MDR的效应和机制目的:初步探讨声学微泡联合超声靶向介导耐药基因ASON转染在体逆转裸鼠肝癌移植瘤MDR的效应及其作用机制。方法:对于肝癌MDR移植瘤裸鼠,按实验分组在体给于实验处理: QGY/CDDP移植瘤给于mrp-ASON+声学微泡+超声, HepG2/ADM移植瘤给于mdr1-ASON+声学微泡+超声,并以相应ASON+阳离子脂质体+超声为阳性对照,相应MDR移植瘤+转染液注入为阴性对照,在体实验结束处死裸鼠,剥离移植瘤块,提取相应移植瘤细胞培养。取对数生长期培养细胞进行MTT药敏检测、RT-PCR测定细胞mdr1及mrp基因mRNA表达、Western-blot检测细胞P-gp及MRP蛋白表达、免疫组化测定细胞凋亡蛋白bcl-2及bax表达和移植瘤细胞膜ATPase活性变化测定。结果:裸鼠肝癌移植瘤在体实验处理后,移植瘤细胞检测发现:mrp-ASON+声学微泡+超声作用QGY/CDDP移植瘤后,与阴性对照组比较,移植瘤细胞对CDDP、ADM、5-FU和AsT四种药物的耐药性明显下调(P<0.05),与阳性组比较,耐药性有一定下调,但差异无显着性意义(P>.05),RI降低。RT-PCR显示:移植瘤细胞mrp基因的mRNA表达下降明显(对mdr1基因的mRNA表达影响较小),较对照组有显着性差异(P<0.05)。Western-blot结果:移植瘤细胞P-gp、MRP表达均有一定下降(MRP绝对值大于P-gp),与对照组比较有显着性差异(P<0.05)。凋亡蛋白的免疫组化结果表明:移植瘤细胞bcl-2、bax有一定变化,与对照组比较差异无显着性意义(P>0.05)。细胞膜ATPase活性变化测定可见:移植瘤细胞的细胞膜ATPase活性有一定上调,但与对照组比较差异无显着性意义(P>0.05)。mdr1-ASON+声学微泡+超声作用HepG2/ADM移植瘤后,移植瘤细胞对ADM、CDDP、5-FU和AsT四种药物耐药性明显下调,与对照组比较有显着性差异(P<0.05),RI降低。RT-PCR显示:移植瘤细胞mdr1基因和mrp基因的mRNA表达明显下降,较对照组有显着性差异(P<0.05)。Western-blot结果表明:移植瘤细胞P-gp、MRP表达明显下降(P-gp绝对值大于MRP),与对照组比较有显着性差异(P<0.05)。凋亡蛋白的免疫组化测定结果显示:移植瘤细胞bcl-2、bax明显变化,较对照组有显着性差异(P<0.05)。移植瘤细胞膜ATPase活性变化检测结果可见:细胞膜ATPase活性有一定上调,与对照组比较有显着性差异(P<0.05)。结论:ASON+声学微泡+超声照射能够在体逆转裸鼠肝癌移植瘤的MDR,声学微泡联合超声比阳离子脂质体结合超声有更好的转染基因ASON的靶向介导作用,显示对肝癌裸鼠移植瘤MDR更强的逆转效应。分析这种现象的可能原因是:超声的照射导致微泡破裂,微泡破裂的空化效应促进了ASON在细胞的转染与表达。裸鼠肝癌移植瘤QGY/CDDP的MDR形成主要是mrp介导机制,与mdr1介导机制和细胞抗凋亡增强机制关系不大,相应逆转细胞MDR的作用是通过下调细胞mrp及其编码蛋白MRP表达来实现的。移植瘤HepG2/ADM的MDR形成是mdr1介导机制、mrp介导机制和细胞抗凋亡增强机制共同作用的结果,以mdr1介导机制为主,相应逆转细胞MDR的作用是通过降低叁机制的作用,尤其是下调mdr1及其编码蛋白P-gp表达来实现。小结1.采用CDDP低浓度递增加量-间歇作用法、直线加速器X-射线照射法分别建立了两株MDR细胞模型:QGY/CDDP和HepG2/ADM。两种细胞都具有较高的MDR特性,QGY/CDDP细胞对CDDP、ADM、5-FU和AsT的耐药指数分别为10.35、5.50、8.51和9.23;HepG2/ADM细胞对CDDP、ADM、5-FU和AsT的耐药指数分别为6.12、30.31、6.94和9.15。2. QGY/CDDP细胞的MDR机制主要是由mrp及其编码蛋白MRP介导,与mdr1介导机制和细胞抗凋亡增强机制关系不大。HepG2/ADM细胞的MDR机制是由mdr1及其蛋白P-gp介导、mrp及其蛋白MRP介导和细胞抗凋亡增强共同发挥作用,但以mdr1及其蛋白P-gp介导机制为主。3.用mdr1、mrp-ASON+声学微泡+超声照射能够部分逆转人肝癌细胞QGY/CDDP、HepG2/ADM的多药耐药,声学微泡联合超声比阳离子脂质体结合超声有更好的转染耐药基因ASON的靶向介导作用,显示出对肝癌细胞株MDR更强的逆转效应。对于QGY/CDDP细胞逆转MDR的作用,mrp-ASON转染明显强于mdr1-ASON转染。对于HepG2/ADM细胞,mdr1-ASON、mrp-ASON转染均有较强逆转肿瘤MDR的作用,mdr1-ASON转染的MDR逆转作用更强。4. MDR肝癌单细胞悬液直接裸鼠皮下注射法接种,能够建立人肝癌裸鼠QGY/CDDP和HepG2/ADM移植瘤模型。移植瘤细胞有高度耐药特性:QGY/CDDP移植瘤细胞对CDDP、ADM、5-FU和AsT的RI依次为9.28、4.50、7.52和8.36;HepG2/ADM移植瘤细胞对CDDP、ADM、5-FU和AsT的RI依次为6.05、27.94、6.73和8.96。5.用mrp-ASON+声学微泡+超声照射能够在体部分逆转人肝癌QGY/CDDP细胞裸鼠移植瘤的MDR,用mdr1-ASON+声学微泡+超声照射能够在体部分逆转人肝癌HepG2/ADM细胞裸鼠移植瘤的MDR;其中声学微泡联合超声比阳离子脂质体结合超声有更好的转染基因ASON的靶向介导作用,显示出对移植瘤MDR逆转效应更强。6.声学微泡联合超声靶向介导耐药基因-ASON转染逆转人肝癌细胞株和移植瘤MDR的可能主要机制是封闭或下调mdr1、mrp及编码蛋白的表达,进而降低细胞耐药性。其它机制可能包括提高细胞对药物的敏感性、提高细胞膜ATPase活性,促进细胞对药物的摄取,上调细胞内药物浓度和改变凋亡基因的表达,使Bcl-2/Bax比例下调等等。声学微泡造影剂联合超声较阳离子脂质体结合超声靶向介导耐药基因ASON转染具有更好的逆转MDR效应的可能原因是:低强度超声照射导致微泡破裂,微泡破裂的空化效应促进了ASON在细胞的转染与表达,进而表现MDR细胞株和移植瘤的耐药性下降。
参考文献：
[1]. 肝癌基因差异表达谱的筛选及EIF3B对肝癌细胞增殖的影响[D]. 江筱荷. 南昌大学. 2014
[2]. 不同侵袭性肝癌基因差异表达的初步研究[D]. 余桂华. 福建医科大学. 2004
[3]. 肝积方对肝郁脾虚因素协同DEN诱导大鼠实验性肝癌基因表达的干预及临床疗效观察[D]. 殷静. 广州中医药大学. 2014
[4]. 肝癌相关基因差异表达的初步研究[D]. 阚学峰. 天津医科大学. 2004
[5]. SPP-1、GDF-15和CXCL-1在人小肝癌中表达的初步研究[D]. 查斌山. 南京医科大学. 2009
[6]. miR-144靶向细胞周期蛋白B1抑制肝癌增殖、迁移和侵袭的初步研究[D]. 谷军生. 郑州大学. 2016
[7]. 广西肝癌高发区肝癌高危人群预警标志物的初步筛选[D]. 何国珍. 广西医科大学. 2012
[8]. 旋毛虫抗Hepa1-6肿瘤效应的研究[D]. 张媛媛. 吉林大学. 2007
[9]. 荧光定量PCR检测肝癌相关基因表达并建立分子诊断指数[D]. 余俊. 天津医科大学. 2011
[10]. 声学微泡联合超声靶向介导耐药基因ASON转染逆转肝癌MDR[D]. 蒋明东. 重庆医科大学. 2007
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