拟南芥SHB1与CCA1相互作用减弱植物光响应并增强其热形态建成的研究

论文摘要

植物生长发育受到多种因素的调控,其中外部因素,如光照、温度、湿度等,对其正常的生长发育具有关键作用。植物的光合作用为其生命活动提供能量,而且光照也可以作为一种输入信号引起植物体内发生相应变化,随时调控植物的生长发育状态。温度也是植物生长发育不可或缺的因子之一,在长期的进化过程中,植物体内也形成了一套复杂的感知以及响应外界温度变化的系统,可以很好地适应环境温度的升高或降低。然而,过强的光照或过激的温度变化均会对植物的生长发育带来不利影响,甚至导致其死亡。因此,探究植物如何感受外界环境的变化以及这种变化如何通过调控内在的信号传导网络以促使植物做出适应性改变,对于我们更好地改良农作物品质及增加产量具有重要的指导意义。本研究在模式植物拟南芥中开展,主要研究SHB1与CCA1/LHY形成的蛋白复合体特异性地在红光条件下调控PIF4基因的表达。PIF4（PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 4）是植物光形态建成过程中关键的负调控因子之一,参与调控植物生长发育的多个方面,同时也是植物热形态建成过程中的关键因子;SHB1（SHORT HYPOCOTYL UNDER BLUE 1）参与调控植物中的蓝光信号转导途径,也通过调控MINISEED3（MINI3）与HAIKU2（IKU2）基因的表达调控胚乳的发育,并最终影响植物种子的大小;CCA1（CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1）是植物生物钟系统中的核心因子,与其高度同源基因LHY（LATE ELONGATED HYPOCOTYL）共同参与调控植物生长发育的多个方面。此项研究发现植物中由SHB1介导的在红光条件下减弱光响应的一个环节,有利于维持植物光形态建成的平衡态,避免光抑制。同时,随着日间温度的逐渐升高,可以增强植物的热形态建成,有利于更好地适应外界温度的变化。本研究从分子、生化以及遗传角度分析了SHB1-CCA1/LHY蛋白复合体调控PIF4基因表达的机制,具体的研究结果如下:（1）SHB1特异性地在红光条件下诱导PIF4基因的表达,而且不会改变其节律表达的模式。在功能获得型突变体shb1-D中,PIF4基因在红光条件下的表达显著升高,而在功能缺失型突变体shb1中,其表达则降低。同时,与野生型相比,两种突变体中PIF4基因节律表达的模式没有改变,只是表达量有所差异。（2）PIF4蛋白水平与转录水平的节律表达模式相一致。PIF4基因的表达在ZT6-ZT9之间达到最高,之后逐渐降低,其蛋白水平也有类似的变化。在由黑暗转移至光照条件时,PIF4蛋白迅速降解,但随着时间的延长,PIF4蛋白又逐渐积累,在ZT6-ZT9时间段内达到最高,之后又逐渐减少。而且,在shb1-D突变体中,PIF4蛋白含量明显高于野生型,shb1中则稍低于野生型,且均不会改变其蛋白水平的节律表达模式。（3）植物生物钟核心因子CCA1/LHY参与调控PIF4基因在红光条件下的表达。在红光条件下,qPCR结果显示cca1、lhy以及cca1 lhy双突变体中PIF4基因的表达下调,而且遗传数据分析表明,尽管CCA1与LHY是高度同源基因,但与野生型相比,cca1或lhy单突变体均表现为短下胚轴,cca1 lhy双突变体的下胚轴则更短。此外,shb1-D cca1lhy三突变体具有与cca1 lhy相似的下胚轴表型,且cca1 lhy双突变体中PIF4基因节律表达的模式消失。（4）SHB1通过上调PIF4基因的表达增强植物的热形态建成。与正常温度条件（20-22°C）下相比,高温条件（27-29°C）下,shb1-D具有显著伸长的下胚轴,且PIF4基因表达明显升高,而cca1 lhy双突变体的下胚轴也会伸长,但仍然短于野生型,shb1-D cca1 lhy三突变体的下胚轴长于cca1 lhy,但明显短于shb1-D,PIF4基因的表达具有类似的模式。（5）SHB1与CCA1/LHY在红光条件下可以结合PIF4基因的启动子。SHB1蛋白不包含DNA结合结构域,ChIP结果显示SHB1与CCA1/LHY均可以结合PIF4基因的启动子,且在cca1 lhy双突变体背景下,SHB1无法结合至PIF4基因的启动子,表明SHB1结合DNA的能力依赖于CCA1/LHY。黑暗条件下,SHB1与CCA1/LHY无法结合PIF4基因的启动子,初步数据表明由ELF3（EARLY FLOWERING 3）、ELF4（EARLY FLOWERING 4）与LUX（LUXARRHYTHMO）组成的夜晚复合体（Evening Complex,EC）在空间上可能阻碍了SHB1与CCA1/LHY结合PIF4基因的启动子的能力。此外,通过不同时间点的ChIP分析,发现SHB1与CCA1/LHY在ZT3-ZT9时间段内可以结合PIF4基因的启动子,这与PIF4基因的节律表达模式相吻合。（6）在黑暗与红光条件下,SHB1均与CCA1/LHY互作。通过BiFC与CoIP分析,发现SHB1能够与CCA1/LHY互作,且在黑暗与红光条件下,二者均可以产生互作。将SHB1蛋白分为N端（包含SPX结构域）与C端（包含EXS结构域）,发现其N端可以与CCA1/LHY互作;而分别将CCA1/LHY分为N端（包含DNA结合结构域）与C端（无已知功能的结构域）,发现其C端能够与SHB1互作。（7）SHB1依赖于CCA1/LHY激活PIF4基因的表达,且这种激活作用依赖于红光。在cca1 lhy双突变体背景下,利用拟南芥叶片的原生质体系统进行转录激活实验,发现当单独转入CCA1或LHY时,对PIF4基因的表达无明显激活作用;单独转入SHB1时,PIF4基因表达也没有变化;当共同转入CCA1/LHY与SHB1时,在红光条件下PIF4基因的表达显著升高。此外,与野生型相比,在phyB-9突变体背景下,转入SHB1无法激活PIF4基因的表达。综上所述,早上高表达的CCA1通过结合PIF4基因的启动子将生物钟信号整合入PIF4介导的信号转导途径,进而招募SHB1至PIF4基因的启动子上,特异性地上调PIF4基因的表达,一定程度上减弱了植物的光响应,有助于维持植物光形态建成的平衡状态。同时,随着日间温度的升高,SHB1通过上调PIF4基因的表达可以增强植物的热形态建成,有助于保证植物在强光、高温条件下正常的生长发育。

论文目录

中文摘要

Abstract

1 前言

1.1 植物光形态建成

1.1.1 植物光受体

1.1.1.1 光敏色素

1.1.1.2 隐花色素与向光素

1.1.1.3 UVR

1.1.2 光敏色素互作因子

1.1.2.1 PIFs的结构特点

1.1.2.2 PIF4 多方面地参与调控植物生长发育

1.2 植物生物节律

1.2.1 拟南芥生物钟核心振荡器的分子机制

1.2.2 光、温信号与生物钟之间的联系

1.3 SHB1 在植物光形态建成中的作用

1.4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株与质粒

2.1.3 酶与试剂

2.1.4 仪器设备

2.1.5 引物

2.2 实验方法

2.2.1 各种培养基配方

2.2.2 植物材料的生长

2.2.2.1 拟南芥种子消毒处理及萌发

2.2.2.2 拟南芥植物的正常生长

2.2.2.3 拟南芥植物的高温条件处理

2.2.2.4 拟南芥幼苗下胚轴长度的测量

2.2.3 构建拟南芥转基因植物

2.2.3.1 植物基因组DNA的提取（SDS法）

2.2.3.2 PCR扩增目的基因片段

2.2.3.3 目的片段的回收（试剂盒法）

2.2.3.4 TOPO TA连接反应

2.2.3.5 大肠杆菌感受态的制备及转化（电转法）

2.2.3.6 PCR筛选方向及质粒提取（试剂盒法）

2.2.3.7 LR反应

2.2.3.8 PCR鉴定阳性菌

2.2.3.9 农杆菌GV3101 感受态的制备与转化（电转法）

2.2.3.10 浸花法转化拟南芥植物

2.2.4 双、三突变体的构建及鉴定

2.2.4.1 拟南芥植物的杂交

2.2.4.2 PCR鉴定纯合突变体

2.2.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

2.2.5.1 植物总RNA的提取（试剂盒法）

2.2.5.2 反转录

2.2.5.3 qRT-PCR的引物设计及合成

2.2.5.4 qRT-PCR的反应体系及结果分析

2.2.6 染色质免疫共沉淀分析（ChIP）

2.2.6.1 染色体与蛋白交联

2.2.6.2 染色体准备（4°C）

2.2.6.3 免疫共沉淀（4°C）

2.2.6.4 洗脱与解交联

2.2.6.5 沉淀DNA

2.2.7 免疫共沉淀分析（Co-IP）

2.2.7.1 植物总蛋白的提取

2.2.7.2 免疫共沉淀

2.2.7.3 Western blot

2.2.8 酵母单杂交（Y1H）

2.2.8.1 pAbAi-Bait质粒的构建及线性化

2.2.8.2 Y1H酵母感受态细胞的制备

2.2.8.3 酵母菌的转化及阳性克隆的筛选

2.2.8.4 pAbAi-Bait酵母菌株的AbA抗性检测

2.2.8.5 制备含有pAbAi-Bait质粒的酵母感受态细胞以及不同GAD质粒的转化

2.2.9 双分子荧光互补分析（BiFC）

2.2.9.1 烟草转化

2.2.10 双分子荧光素酶活性分析

2.2.10.1 拟南芥叶片原生质体的提取与转化

2.2.10.2 LUC/REN活性检测

3 结果与分析

3.1 SHB1、CCA1/LHY特异性地在红光条件下调控PIF4 的表达

3.1.1 SHB1 在红光条件下特异性地诱导PIF4 基因表达

3.1.2 SHB1 在红光条件下促进PIF4 蛋白积累

3.1.3 CCA1、LHY参与调控PIF4 基因表达

3.2 SHB1、CCA1、LHY与 PIF4 的遗传关系鉴定

3.3 SHB1与CCA1/LHY上调PIF4 基因表达可增强植物的热形态建成

3.4 SHB1 通过CCA1/LHY关联至PIF4 基因启动子区域

3.4.1 SHB1 在红光条件下与PIF4 基因启动子相关联

3.4.2 CCA1/LHY在红光条件下可结合至PIF4 基因启动子

3.4.3 CCA1/LHY在黑暗条件下无法结合PIF4 基因启动子

3.4.4 SHB1与CCA1/LHY结合PIF4 基因启动子符合PIF4 基因的节律表达模式

3.5 CCA1/LHY可直接结合至PIF4 基因启动子中的M1 元件

3.6 SHB1与CCA1/LHY相互作用

3.7 SHB1 N端与CCA1/LHY C端互作

3.8 CCA1/LHY与 SHB1 共同作用于PIF

4 讨论

4.1 SHB1 通过上调PIF4 表达有助于维持植物光形态建成的动态平衡

4.2 SHB1 特异性地调控PIF4 基因的表达

4.3 PIF4 蛋白水平与转录水平具有一致的节律表达模式

4.4 CCA1/LHY在黑暗条件下无法结合至PIF4 基因启动子

4.5 SHB1-CCA1/LHY复合体结合PIF4 基因启动子符合其节律表达模式

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况

文章来源

类型: 博士论文

作者: 孙庆彬

导师: 倪敏

关键词: 红光,光形态建成,热形态建成

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山东农业大学

基金: 国家自然科学基金面上项目(31470379)

分类号: Q945

总页数: 114

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拟南芥SHB1与CCA1相互作用减弱植物光响应并增强其热形态建成的研究

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