aurJ3M、aurT基因对金褐霉素生物合成的调控作用研究

论文摘要

金褐霉素（Aureofuscin）是由金褐链霉菌（Streptomyces aureofuscus）产生的一种次级代谢产物,属于四烯大环内酯类抗生素,具有抗真菌活性,有待应用在医疗卫生、食品加工等更广泛的领域。因其生物合成的调控机制尚未明确,金褐霉素的产量较低,限制其进一步应用,所以提高金褐霉素的产量成为重中之重。前期实验通过在金褐链霉菌中过表达aurJ3M基因,高效液相色谱（HPLC）分析检测发酵产物,金褐霉素产量提高5-6倍。本论文针对aurJ3M和aurT的功能和调控作用进行近一步研究。（1）生物信息学分析表明,在金褐链霉菌中存在属于PAS-LuxR家族的调控因子AurJ3M（EU697915.1）,构建aurJ3M基因敲除质粒pC1203-11599,通过发酵产物形态观察,HPLC测定aurJ3M基因敲除突变株（ΔaurJ3M）不能合成金褐霉素,初步证实aurJ3M基因对金褐霉素的生物合成起正向调控作用;进一步通过反转录PCR实验分析,与野生型菌株相比,在ΔaurJ3M中聚酮合成酶基因S0、S1和基因B、C、G、F、D均不发生转录,I、J、A基因转录水平显著降低,R、E、H基因的表达不受影响,S0和S1基因的不表达都会抑制金褐霉素产生。结果显示aurJ3M是金褐霉素生物合成的途径特异性调节因子,通过调节基因簇中结构基因的转录表达来影响金褐霉素的合成。（2）通过分子克隆,获得了新基因aurT（Genbank登录号:MH247109.1）,生物信息学分析AurT蛋白结构表明AurT属于RhtB家族调控因子,是金褐链霉菌的氨基酸转运蛋白,aurT基因过表达菌株（♂aurT）中金褐霉素产量提高了1.3倍,aurT基因敲除菌株（ΔaurT）金褐霉素产量损失了65%,但仍有金褐霉素产生,并没有完全抑制其生产,这与途径特异性调控因子AurJ3M的调控方式不同。（3）以野生型菌株S.aureofuscus SYAU0709为对照,筛选添加四种不同PI因子结构类似物（1,2-丙二醇、丙三醇、乙二醇、三乙醇胺）,结果显示外源添加质量浓度为0.4mL的丙三醇,发酵时间达96h时,对调控金褐霉素的合成效果最佳;另外与野生型菌株S.aureofuscus SYAU0709的金褐霉素产量(693μg·mL-1)相比,外源添加丙三醇后产量提高了1.5倍(1034μg·mL-1),ΔaurT菌株金褐霉素产量243μg·mL-1,外源添加丙三醇后产量提高到784μg·mL-1,与野生型菌株S.aureofuscus SYAU0709的产量接近,检测发酵产物发现又恢复了金褐霉素野生型菌株的产量。表明质量浓度为0.4mL的PI-因子结构类似物与基因簇内特异性受体结合,启动相关基因的表达,参与金褐霉素的生物合成调控。

论文目录

摘要

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第1章绪论

1.1 金褐霉素概述

1.1.1 金褐霉素特性

1.1.2 生物学活性

1.2 金褐霉素生物合成研究进展

1.2.1 生物合成基因簇预测

1.3 链霉菌次级代谢调控研究进展

1.3.1 途径特异性调控

1.3.2 全局多效性调控

1.4 链霉菌次生代谢调控与群感效应研究进展

1.5 本文的研究内容及目标

第2章途径特异性调控因子aurJ3M的调控作用

2.1 实验材料与仪器设备

2.1.1 菌株、质粒

2.1.2 所用引物

2.1.3 实验试剂

2.1.4 培养基

2.1.5 抗生素

2.1.6 仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 AurJ3M生物信息学分析

2.2.2 Streptomyces aureofuscus SYAU0709 基因组DNA的抽提

2.2.3 大肠杆菌质粒DNA的抽提

2.2.4 Streptomyces aureofuscus SYAU0709 孢子悬液的制备

2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

2.2.6 PCR、酶切及连接

2.2.7 琼脂糖凝胶电泳、核酸片段回收与纯化

2.2.8 aurJ3M基因敲除载体构建

2.2.9 E.coli ET12567 和链霉菌S.aureofuscus的属间接合转移

2.2.10 Real-time PCR分析金褐霉素生物合成基因簇基因

2.2.11 金褐霉素生物量、发酵单位的测定

2.3 结果与分析

2.3.1 金褐霉素生物合成基因簇内AurJ3M生物信息学预测分析

2.3.2 aurJ3M基因敲除载体的构建及验证

2.3.3 ΔaurJ3M转录水平分析

2.3.4 基因aurJ3M的敲除对金褐霉素发酵产量的影响

2.4 本章小结

第3章 aurT基因对金褐霉素生物合成的影响

3.1 实验材料与仪器设备

3.1.1 菌株与质粒

3.1.2 引物

3.1.3 试剂

3.1.4 培养基

3.1.5 抗生素

3.1.6 仪器设备

3.2 实验方法

3.2.1 基因组DNA的抽提

3.2.2 质粒DNA的抽提

3.2.3 孢子悬液的制备

3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及连接产物的转化

3.2.5 PCR、酶切及连接

3.2.6 琼脂糖凝胶电泳、核酸片段回收与纯化

3.2.7 aurT基因过表达载体的构建

3.2.8 aurT基因敲除载体构建

3.2.9 E.coli ET12567 和链霉菌的接合转移

3.2.10 过表达aurT基因对菌体生长代谢的影响

3.3 结果与分析

3.3.1 aurT基因的克隆、测序及过表达载体的构建

3.3.2 过表达菌株Streptomyces aureofuscus♂aurT的筛选及验证

3.3.3 aurT敲除突变株的构建

3.3.4 过表达菌株♂aurT对菌株生长代谢的影响

3.3.5 敲除菌株ΔaurT对菌株生长代谢的影响

3.4 本章小结

第4章 PI因子对金褐霉素生物合成的影响

4.1 材料与方法

4.1.1 菌株

4.1.2 培养基

4.1.3 仪器

4.2 实验方法

4.2.1 单因素分析筛选PI因子结构类似物

4.2.2 紫外分光光度计测定金褐霉素

4.2.3 金褐链霉菌生长曲线的确定

4.3 结果与分析

4.3.1 Aureofuscin标准曲线

4.3.2 单因素实验结果

4.3.3 添加丙三醇对S.aureofuscus SYAU0709和ΔaurT产量的影响

4.4 本章小结

第5章结论与展望

致谢

参考文献

攻读学位期间发表学术论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 许德馨

导师: 魏杰

关键词: 金褐霉素,基因敲除,因子

来源: 辽宁大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 辽宁大学

分类号: Q939

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