首页> 正文

血小板整合素αⅡbβ3及相关配体蛋白Tablysin-15、CagL的理化性质研究

2020-12-09阅读(378)

血小板整合素αⅡbβ3及相关配体蛋白Tablysin-15、CagL的理化性质研究

论文摘要

多细胞生物生命活动的基础是细胞粘附,通常由细胞粘附分子（Cell Adhesion Molecule,CAM）介导。整合素（Integrin,又称整联蛋白）是细胞粘附分子家族的重要组成部分,由α和β两个亚单位组成。本项目研究的整合素αⅡbβ3在血小板表面上具有很高的表达量,是血小板膜的主要受体,负责介导血小板的粘附和聚集,参加血小板活化的双向信号转导,并参与血栓的形成。整合素受体与细胞外基质粘附的识别位点是含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）基序多肽,因此RGD基序常常用于开发不同的整合素拮抗剂。Tablysin-15和CagL是具有一定空间构象的RGD基序蛋白,可以与细胞粘附受体发生特异性结合。Tablysin-15是在牛虻唾液腺中提取的蛋白,牛虻在吸血时,Tablysin-15会释放到口器周围,由于与αⅡbβ3具有较高的亲和力就会与其结合,阻碍口器周边的血液凝固,利于牛虻取食血液。CagL是一种幽门螺杆菌外膜伴侣蛋白,通过与宿主细胞膜上的整合素相互作用,进而发挥其生物学功能。目前整合素拮抗剂的研究策略大部分集中在阻断生理性配体与整合素的结合上,通过研究含有RGD多肽的蛋白与整合素的结合,从而调整和影响整合素的功能。结构生物学是测定生物大分子空间结构和分子间相互作用的强有力的技术手段。解析整合素及其相关的重要蛋白的三维结构,并阐明这些蛋白之间的相互作用及其机制,将有助于人们更好地理解整合素发挥功能的结构基础和分子机制,研制新型抗血栓药物或治疗因αⅡbβ3病变导致的血小板机能不全综合症,以及血小板减少症等,提供重要的理论依据和潜在的新药靶。本项目利用分子生物学和结构生物学方法和异核多维核磁共振的结构测定技术,构建了整合素αⅡbβ3胞内区加跨膜区的原核表达载体、胞内区的原核表达载体,摸索并优化了重组子表达纯化条件,最终制备出胞内区大量的、稳定的及高纯度的蛋白样品。用多种生物物理技术对Tablysin-15和CagL蛋白进行了包涵体变复性及理化性质表征:Tablysin-15的一维1H谱在化学位移0 ppm附近,有尖锐的甲基峰,在化学位移6-8 ppm之间有着比较宽的分布,初步认为蛋白折叠较好,可以进一步通过NMR技术解析三维结构及研究其分子动力学。CagL蛋白的一维1H谱在化学位移0 ppm附近,有尖锐的甲基峰,在化学位移6-8 ppm之间有着比较宽的分布,但1H-15N HSQC实验表明谱峰在中间部分比较拥挤,并且峰的大小不太均一,表明蛋白溶液易聚集,结构折叠不好,意味着通过生物NMR技术解析三维结构还需要继续摸索纯化条件,帮助蛋白正确折叠。我们的研究结果为下一步解析Tablysin-15和CagL蛋白的核磁三维结构及与整合素αⅡbβ3相互作用位点,为深入阐明整合素的功能奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 1 前言
  •   1.1 整合素的概况
  •   1.2 幽门螺杆菌IV型分泌系统菌毛蛋白CagL
  •   1.3 抗血管生成蛋白Tablysin-
  •   1.4 生物大分子的核磁共振技术
  •   1.5 研究目的和意义
  • 2 材料与方法
  •   2.1 试验材料
  •     2.1.1 菌株与载体信息
  •     2.1.2 主要试剂及耗材
  •     2.1.3 主要仪器
  •   2.2 主要试剂配制
  •     2.2.1 基因克隆与蛋白表达试剂的配制
  •     2.2.2 蛋白纯化试剂的配制
  •     2.2.3 凝胶电泳试剂的配制
  •   2.3 试验方法
  •     2.3.1 重组质粒的构建
  •     2.3.2 重组质粒的转化
  •     2.3.3 目的蛋白的表达
  •     2.3.4 目的蛋白的纯化
  •     2.3.5 蛋白质的检测和定量
  •     2.3.6 动态光散射实验
  •     2.3.7 蛋白的圆二色谱（CD）实验
  • 1H、2D1H-15N HSQC谱图的采集'>    2.3.8 蛋白的1D1H、2D1H-15N HSQC谱图的采集
  • 3 结果
  • Ⅱb和 β3 的胞内区和跨膜区的克隆及表达'>  3.1 整合素αⅡb和 β3的胞内区和跨膜区的克隆及表达
  •     3.1.1 PCR结果
  •     3.1.2 测序验证
  •     3.1.3 目的蛋白的小量表达
  • Ⅱb和 β3 的胞内区的克隆及表达纯化'>  3.2 整合素αⅡb和 β3的胞内区的克隆及表达纯化
  •     3.2.1 PCR结果
  •     3.2.2 测序验证
  •     3.2.3 目的蛋白小量表达及表达条件的优化
  •     3.2.4 目的蛋白的大量表达和亲和层析纯化
  •     3.2.5 目的蛋白的凝胶过滤层析纯化及酶切
  •   3.3 Tablysin-15 蛋白表达纯化及表征
  •     3.3.1 Tablysin-15 表达纯化
  •     3.3.2 Tablysin-15 的二级结构表征
  •     3.3.3 Tablysin-15 的粒径测定
  •     3.3.4 Tablysin-15的NMR分析
  •   3.4 CagL蛋白表达纯化及表征
  •     3.4.1 CagL蛋白的表达纯化
  •     3.4.2 二级结构测定
  •     3.4.3 粒径测定
  •     3.4.4 CagL的 NMR分析
  • 4 讨论
  •   4.1 影响蛋白表达的因素
  •   4.2 真核基因在原核细胞中的表达特点
  •   4.3 研究蛋白质与配体相互作用的方法
  •   4.4 NMR技术用于解析蛋白与配体的相互作用
  •   4.5 NMR技术用于解析蛋白的动力学
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 孙兴盛

    导师: 刘家福

    关键词: 整合素

    来源: 东北农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 东北农业大学

    分类号: Q51

    总页数: 60

    文件大小: 2964K

    下载量: 30

    相关论文文献

    • [1].整合素家族与肿瘤骨转移相关性研究进展[J]. 现代肿瘤医学 2011(03)
    • [2].胃癌侵袭和转移相关非整合素家族分子的研究进展[J]. 实用临床医学 2009(12)
    • [3].整合素家族与甲状腺癌[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志 2015(04)
    • [4].整合素家族对脓毒症血管屏障功能的影响[J]. 心脑血管病防治 2014(01)
    • [5].白细胞介素10与整合素家族细胞黏附分子在急性坏死性胰腺炎合并多器官损伤大鼠模型中的表达[J]. 实用医学杂志 2008(02)
    • [6].β整合素家族在儿童急性T淋巴细胞白血病的表达及其临床意义[J]. 中国当代儿科杂志 2017(06)
    • [7].家蚕整合素β2的表达、纯化及其免疫功能[J]. 中国农业科学 2019(01)
    • [8].整合素β1在肿瘤研究中的进展[J]. 临床合理用药杂志 2018(11)
    • [9].整合素与肝脏疾病[J]. 肝脏 2019(04)
    • [10].家蚕整合素Bmintegrin β1基因的克隆及表达[J]. 生物工程学报 2017(12)
    • [11].整合素在烧伤创面愈合中的作用研究进展[J]. 中华损伤与修复杂志(电子版) 2018(02)
    • [12].整合素β4研究进展[J]. 生理学报 2018(05)
    • [13].几种靶向抑制整合素αvβ3多肽的设计及活性比较[J]. 中国生物制品学杂志 2018(12)
    • [14].整合素与肝纤维化[J]. 肝脏 2019(07)
    • [15].α_vβ_3整合素与恶性肿瘤侵袭转移关系的研究进展[J]. 现代生物医学进展 2015(23)
    • [16].整合素通路参与器官纤维化过程的研究进展[J]. 疾病监测与控制 2019(04)
    • [17].甲状腺微小乳头状癌潜在高风险侵袭性的生物信息学初步分析[J]. 中国耳鼻咽喉头颈外科 2020(08)

    标签：;  

    血小板整合素αⅡbβ3及相关配体蛋白Tablysin-15、CagL的理化性质研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6